鉴定两种新的保守线性表位，并开发了一种阻断ELISA方法，用于通用血清学检测PEDV

《International Journal of Biological Macromolecules》：Identification of two novel conserved linear epitopes and development of a blocking ELISA for universal serological detection of PEDV

本研究通过分子模拟和实验验证，鉴定出PEDV核衣壳蛋白的两个新保守线性表位，并建立高特异性的阻断ELISA检测方法，为病毒监测和疫苗评估提供新工具。

　　

吴琦|袁敏|姜双|周赛赛|吴淑辉|韩莉|李龙|张安婷

中国湖北省武汉市华中农业大学兽医学院，湖北洪山实验室，农业微生物国家重点实验室，430070

摘要

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种高度传染性的急性冠状病毒，会导致仔猪严重死亡，并威胁全球养猪业。PEDV的广泛变异限制了疫苗的效果，因此需要通用抗体检测方法来监测感染情况并评估疫苗诱导的免疫力。PEDV的核衣壳（N）蛋白能够引发早期的高滴度抗体反应，使其成为理想的诊断靶标。本文我们生成了两种针对PEDV N蛋白的单克隆抗体（mAbs）。通过分子对接、分子动力学模拟和截断实验，我们确认了抗体与N蛋白的稳定结合，并鉴定了两个高度保守的线性表位：¹³⁹TPPASRANSRSR¹⁵¹ 和 ⁴³²IINEIFDTGN⁴⁴¹。利用mAb-4H7开发了一种阻断ELISA（bELISA），其抑制率（PI）临界值为27.62%，特异性达到98.00%，敏感性达到98.59%，能够清晰区分血清学结果。该检测方法具有1:32的分析灵敏度，对其他5种猪病原体无交叉反应，重复性良好。临床验证显示，其与PEDV-ELISA（IgG）试剂盒的结果一致率为97.92%。本研究提供了保守的表位靶标和强大的诊断工具，有助于PEDV的监测、疫苗评估和基础N蛋白研究，为综合控制PEDV提供了支持。

引言

猪流行性腹泻（PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的急性且高度传染性疾病，已给全球养猪业带来巨大经济损失[1]、[2]。PEDV属于阿尔法冠状病毒属。该病毒通过破坏肠道上皮细胞和缩短绒毛，导致新生仔猪出现急性腹泻、呕吐、脱水和发热等症状[3]、[4]、[5]、[6]。一周龄内的仔猪死亡率接近100%，表明其威胁极为严重[6]。该病毒于1977年首次在比利时被分离出来[7]、[8]。在过去四十年中，PEDV在欧洲、北美和亚洲广泛传播。2010年，一种PEDV变种在中国引发大规模暴发，导致家猪群体广泛感染[5]，尤其是母猪和仔猪的损失尤为严重。同期，在欧洲、北美和亚洲也检测到了基因变异的PEDV株[2]、[9]、[10]、[11]。截至2026年，PEDV已传播至90多个国家和地区，给中国的养猪业造成重大经济损失，并对全球养猪业产生了显著影响[12]。除了感染猪的肠道绒毛上皮细胞外，PEDV还能感染包括人类、猴子、蝙蝠和老鼠在内的多种物种的细胞，增加了跨物种传播的风险[4]。因此，预防和控制PEDV不仅对养猪业至关重要，也对人类和其他物种的健康具有重要意义[13]、[14]。

PEDV的高传染性和高死亡率使其防控成为全球养猪业面临的主要挑战之一。目前，疫苗接种是全球控制PEDV的主要手段；然而，不同病毒株之间的差异导致疫苗对变异株的效果不佳[15]。因此，在PEDV感染或免疫后监测猪体内的抗体水平对于评估免疫效果、制定合理的免疫计划以及实现更全面的PEDV控制至关重要。

PEDV是一种有包膜的单链正链RNA病毒。核衣壳（N）蛋白包裹着PEDV基因组，是不同分离株中最保守的蛋白[3]。在免疫反应过程中，N蛋白可以在病毒感染的早期诱导机体产生高滴度的抗体[1]。这些特性使得N蛋白成为感染早期或免疫早期快速检测的理想靶标，降低漏检的概率。目前，大多数临床抗体检测方法针对的是S蛋白。虽然S蛋白可以诱导宿主产生中和抗体，但其保守性较差[16]、[17]。因此，在多种病毒基因型混合感染以及突变株不断出现的复杂情况下，漏检的风险极高。此外，大多数获批的检测方法都是基于间接ELISA的抗体检测方法，容易产生假阳性结果[18]、[19]。因此，开发一种针对N蛋白的特异性抗体检测方法对于准确全面地监测猪群免疫后的抗体水平至关重要。

为了开发一种特异性强且灵敏的抗体检测方法，制备针对保守抗原表位的单克隆抗体（mAbs）并建立基于bELISA的抗体检测方法是非常必要的。迄今为止，免疫表位数据库（IEDB）中仅收录了4个有效的表位序列（https://www.iedb.org/）。赵等人[20]、孙等人[21]、王等人[17]通过实验鉴定了多个抗原表位。然而，关于N蛋白表位的研究仍远未全面。此外，基于保守表位开发的准确抗体检测方法也较为缺乏。在此背景下，本研究成功获得了具有优异免疫原性的N蛋白，并生成了两种小鼠来源的mAbs。通过实验检测和生物信息学分析，鉴定了两个新的保守抗原表位。此外，还建立了一种高灵敏度和特异性的基于bELISA的方法来检测PEDV N蛋白。本研究为养猪场监测PEDV抗体提供了高效的新工具，解决了临床PEDV抗体检测中的假阴性问题，对预防和控制养猪场的腹泻疾病具有重要意义。

部分内容摘录

细胞、病毒、血清和动物

我们实验室保存了过表达氨基肽酶N的非洲绿猴肾细胞（Vero-APN）和小鼠骨髓瘤细胞（Sp2/0）。本研究中使用的PEDV株是在我们实验室分离的；PEDV N抗体阳性和阴性血清是通过武汉科倩生物有限公司的PEDV-ELISA（IgG）试剂盒检测并保存在我们实验室的；CSFV、PoRVA、SS、PCV-2和JEV的标准阳性血清也保存在实验室中；BALB/c小鼠购自

N蛋白的保守性和表达分析

N蛋白的保守性分析显示，不同PEDV血清型之间的大多数氨基酸高度保守，而399、408和412位置的氨基酸保守性较低（图1A）。原核表达的N蛋白通过His标签镍柱纯化，得到高纯度蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后经考马斯亮蓝染色，显示出一个单一条带

讨论

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种高度传染性的病原体，会导致新生仔猪出现急性症状，死亡率接近100%，对养猪业构成严重威胁[1]、[5]。目前，中国各地出现了多种PEDV变种株，导致猪群广泛感染并造成重大经济损失。疫苗接种是目前主要的预防和控制措施；然而，

CRediT作者贡献声明

吴琦：监督、方法学设计、数据管理、概念构思、初稿撰写。袁敏：方法学设计。姜双：方法学设计。周赛赛：方法学设计。吴淑辉：数据管理、撰写-审稿与编辑。李莉：方法学设计、撰写-审稿与编辑。张安婷：资金获取、数据管理、概念构思。

伦理审批

本研究中的所有动物实验均遵循华中农业大学实验动物中心的伦理指南，并获得了华中农业大学实验动物中心动物伦理委员会的批准（批准编号：HZAUMO-2025-0271）。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本文时，作者使用了Ernie Bot来提高手稿的可读性和语言表达。使用Ernie Bot后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本项工作得到了中国教育部基础与交叉学科突破计划（JYB2025XDXM704）、武汉市科技重大项目（2023020302020573）、湖北省自然科学基金（2024AFB146）、丝绸之路经济带创新驱动转型试验区以及乌鲁木齐-昌吉国家自主创新示范区科技创新计划项目-高质量的财政支持