《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Circular Nucleic Acid Synthesis: Enzymatic, Chemical, and Emerging Strategies for Diagnostic and Bioengineering Applications
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这篇综述系统性总结了环状DNA、RNA及RNA-DNA杂合体在生物传感、基因治疗和分子诊断领域的最新合成进展。文章深入探讨了酶促（如T4 DNA ligase、CircLigase）与化学（如BrCN、点击化学）连接方法，重点分析了模板/发夹结构对环化效率的影响，并比较了不同方法在产率、纯度及下游应用（如滚环扩增RCA、CRISPR-Cas传感）中的表现。最后，文章展望了环状核酸合成在提升CRISPR检测灵敏度、开发新型诊断工具等方面的未来方向。
环状核酸合成：酶促、化学及新兴策略在诊断与生物工程中的应用
1. 引言
核酸扩增是确保医学和生物学中灵敏、准确诊断的关键技术。近年来，核酸诊断和治疗领域取得了显著增长，其中环状DNA因其独特的拓扑结构而受到特别关注。环状DNA结构能够实现靶核酸的等温扩增，无需如PCR般复杂的变温步骤，并且其共价闭合的拓扑结构提供了强大的抗核酸外切酶降解能力，从而实现了诸如滚环扩增或转录（RCA/RCT）以及高灵敏度的基于CRISPR的生物传感等应用。环状单链DNA（CssDNA）最早于20世纪60年代在噬菌体病毒PhiX174中被发现。与双链和线性DNA相比，CssDNA在稳定性、特异性和免疫原性方面表现出增强，这促使人们进一步研究环状DNA在其他生物学应用中的潜力。
环状DNA最早的应用之一是作为DNA的三链形成配体，与线性链相比显示出更高的结合亲和力和特异性。与环状DNA形成的DNA三链体由于阻断了寡核苷酸末端的5'磷酸和3'羟基，阻止了大多数核酸外切酶的降解，因此比线性链更稳定。这在未稀释的人血清中得到了验证，发现完全环化的DNA的半衰期与线性寡核苷酸相比从30分钟增加到>2天。这些DNA结构赋予的核酸酶抗性使得其在靶向抑制DNA和蛋白质合成中得以应用。环状RNA结构的研究也显示出类似的高结合亲和力和特异性优势，但已发现环状RNA对核酸酶降解的抗性较低。
环状DNA结构一个被广泛报道的用途是滚环扩增（RCA）和滚环转录（RCT）。长期以来，人们已经理解RCA和RCT是自然界中环状质粒和病毒基因组复制的机制。这导致了合成环状DNA的发展，以作为扩增所需靶序列的模板。在该方法中，靶序列的多个串联重复在长的多聚体链中产生，从而放大了样品中的靶拷贝。此后，RCA已被应用于生物技术的许多领域，包括作为PCR扩增的等温替代方案；与酶联免疫吸附测定（ELISA）结合用于抗原检测；通过结合DNA适配体进行蛋白质检测；以及特异性检测具有小单核苷酸多态性的miRNA。
近年来，环状DNA结构已被进一步改造用于CRISPR-Cas12生物传感。在该应用中，线性ssDNA被环化，然后与一个略短的互补序列杂交，形成一个带有短（通常为3-6 nt）单链区域的环状dsDNA。环状ssDNA链被设计为与Cas核糖核蛋白（RNP）的向导RNA互补。由于DNA环的核酸酶抗性拓扑结构，Cas RNP不易识别并结合环化的dsDNA链。然而，当引入另一个Cas RNP并通过靶DNA或RNA激活反式切割时，Cas酶切割短ssDNA序列，将序列线性化并恢复第二个Cas RNP识别和结合的能力。通过这种方式，单个靶核酸分子可以激活多个Cas酶，从而产生由切割的基于FRET的核酸报告基因揭示的指数级信号级联。实际上，使用环状DNA纳米结构已被发现可将CRISPR灵敏度从皮摩尔提高到阿托摩尔范围。这种灵敏度的显著提高使得基于CRISPR的生物传感能够以更简单、更具成本效益的方法与PCR相媲美。然而，生产高性能的环状结构仍然具有挑战性，其在基于CRISPR的生物传感中的最佳设计和全部应用范围仍在研究中。
自1974年发现T4 DNA连接酶以来，已经开发了各种环状核酸合成方法的研究，包括酶促和化学连接。尽管取得了这些进展，但环状核酸开发中的一个关键挑战是确保精确的分子内合成、高产率和纯度以及最小的批次间差异。重要的障碍包括防止连接过程中形成聚集体和额外的串联体核酸结构、不完全连接留下的剩余线性前体，以及连接酶和特殊缓冲液组分的存在，这可能对下游应用（如CRISPR传感反应）产生影响。与低环纯度相关的问题可能导致某些测定中出现较高的背景信号，特别是在自催化CRISPR测定中，其中少量未环化的核酸残余可导致信号出现大的可观察差异。因此，环化产物的纯化可能在环状核酸应用中起重要作用。浓度上的大批次间差异、纯度缺乏以及串联体、高阶环状结构的存在可能使纯化复杂化。解决这些问题对于开发标准化和可靠的环化方法至关重要。
在这篇综述中，我们旨在通过研究各种环状核酸合成方法来解决这一空白，特别关注它们在CRISPR生物传感中的潜在应用。首先，我们描述了各种环状DNA合成方法，包括主要的酶促和化学方法。其次，我们研究了RNA环合成的酶促方法。最后，我们总结了改进环状核酸合成的潜在未来方向，以及使用新兴技术（如CRISPR）的潜在进一步应用。因此，本综述不仅关注DNA和RNA纳米环形成的合成原理，还关注合成诱导的结构和化学特征如何控制其在基于CRISPR的生物传感、滚环扩增和转录以及新兴生物工程应用中的性能。
2. DNA环合成
线性DNA链的环化形成环状结构可以通过两种主要方法实现：酶促或化学连接。酶促环化方法目前是最常用的，部分原因是其低成本、可扩展性和相对简单性，并已用于生产各种大小的DNA环，长度范围从≥16 nt到2668 nt。适用于DNA环化的连接酶包括T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶、CircLigase和HIFI Taq DNA连接酶等，其中T4连接酶被认为是实验室标准。DNA环合成的酶促和化学方法通常依赖于使用夹板结构，该结构将线性前体的连接末端紧密靠近，从而促进连接。
2.1. 模板和夹板设计
文献中已经提出了各种夹板设计，包括线性、含有末端发夹结构的哑铃状结构或DNA适配体。使用的夹板类型取决于合成方法。例如，当与两个不同的线性前体形成三链结构时，线性夹板链是有益的，这两个前体可以结合到夹板序列的不同部分。多个线性模板也可以组合以从几个前体序列合成更大的环（>200 nt），这在使用单夹板方法时通常具有挑战性。夹板序列的修饰似乎显着影响连接效率。例如，Kim等人发现，在夹板序列中添加一个单核苷酸"间隙"区域，该区域对线性前体末端是非特异性的，因此将连接末端额外分隔一个核苷酸，增加了使用T4 RNA连接酶2时circRNA的连接效率。Paluzzi等人进一步改进了设计，设计了一个哑铃状夹板，该夹板由用于前体链的短ssDNA线性结合序列组成，两端各有两个短发夹环约束。发现发夹结构极大地提高了连接效率，实现了近乎完全的环化，并且对于合成高纯度的小于30 nt的环特别有益。最后，DNA适配体正在成为直接连接环状核酸的替代模板。使用DNA适配体的一个好处是，它们可以精确设计为包含二级结构，如发夹和茎环，为分子内连接提供类似于前述发夹夹板设计的增强效果。总体而言，夹板设计是高效环状核酸合成的关键因素。下文将更详细地描述使用和不使用夹板的连接方法。
2.2. DNA环合成的酶促方法
2.2.1. 基于T4连接酶的方法
T4连接酶对DNA的环化要求线性DNA具有5'-磷酸基团，并形成dsDNA结构以促进线性DNA末端之间磷酸二酯键的形成。对于双链DNA环的合成，线性dsDNA可以设计为平末端（两条链在同一核苷酸配对处终止）和/或"粘性"末端（其中5'-磷酸基团末端比另一条链突出一个或多个核苷酸）。连接两个粘性末端比连接平末端效率更高。夹板方法的一个缺点是夹板结构需要额外的合成步骤（或可以从供应商处购买），并且需要在连接后去除，这通常需要使用外切核酸酶等酶进行纯化。这些额外步骤增加了DNA合成的成本。
Lohmann等人描述了使用T4连接酶而不使用夹板合成环状ssDNA的方法，而是使用称为自杀盒的自模板发夹将线性DNA的末端拉近。由此产生的ssDNA环包含一个发夹区域，然后用于靶序列的RCA，促进进一步的环生产。然而，该方法复杂，需要许多合成和消化步骤，此后夹板方法已成为生产DNA环的标准。Sun等人采用了一种无夹板、自模板的方法，其中工程化的置换前体链具有自结合区域，前体的两端在邻近处结合，形成分子内动态切口。包含在dsDNA底物上的切口区域然后可以用T4 DNA连接酶连接。作者使用该方法生产了长度为62 nt的环，效率为97%。与dsDNA相比，合成ssDNA环的一个主要优点是，由于单个磷酸主链的灵活性增加，可以生产更小的环尺寸。基于这一原理，2001年，Diegelman和Kool建立了一个使用T4连接酶生产小ssDNA环的基础方案，该方案后来成为后续方法的基础。该方法能够在"一锅"环化方案中使用双螺旋夹板合成长度从28到188 nt的ssDNA环。作者可以使用单个线性前体序列生产短于50 nt的环，而更长的环（>140 nt）则通过多个线性序列的连接产生。Seidl等人和Wang等人使用这种方法生产了用于miRNA的RCT合成的环状DNA模板。
T4连接程序此后经历了各种改进以提高效率和产率。例如，Ran等人开发了一种使用低浓度Mg(II)合成ssDNA环的方法，该方法通过减少分子间相互作用提高了合成效率。Mg2+离子是T4连接酶缓冲液的关键组分，仅仅降低缓冲液的浓度就大大减少了较大的、不需要的DNA串联体（聚合物）的形成，而仅略微影响ssDNA环的形成速率。此外，作者发现，通过将线性DNA分成较小的部分并间歇性地将它们添加到连接酶缓冲液中，在添加下一份之前给每份约20分钟的连接时间，进一步减少了不需要的聚合物的形成，从而进一步提高了环状ssDNA合成的效率。使用新开发的方法，作者合成了长度从31到74 nt的ssDNA环，具有不同的效率，对于72 nt和66 nt的ssDNA环，效率分别高达99.7%和89%。Cui等人通过在用于环化的线性DNA序列中添加发夹结构，进一步提高了选择性。发夹结构的位置影响连接效率：当发夹靠近5'末端的连接位点时，连接效率高达100%。相反，当发夹远离连接位点时，效率降至45%。作者通常发现更长的环长度具有更好的连接效率，74 nt的选择性几乎为100%，而64 nt和54 nt大小的选择性分别为93-94%。当环化小于50 nt的线性序列时，效率显着下降，44 nt和34 nt的效率分别为67%和14%。
迄今为止描述的环合成方案是针对20 nt范围内的环长度开发的。然而，由于较短的序列更容易因分子间连接而形成串联体，因此较小环的产率和选择性通常低于50-150 nt范围内的环。造成这种限制的一个原因是，使用传统夹板，需要在线性链的每一端形成至少6 bp的重叠（总共12 bp）才能实现高效连接。环化会对线性链施加机械应力，较短的序列承受更大的张力。如果这种张力变得太大，则分子间连接往往比预期的分子内环化更受青睐。
为了更有效地生产长度小于30 nt的短环，Paluzzi等人开发了一种改进的夹板设计，其中夹板的末端形成小的发夹结构，在中心留下一个短ssDNA结合区域，以促进线性DNA的互补末端靠近。当与线性ssDNA序列结合时，发夹茎和线性-夹板双链体之间的碱基堆积增加了结构的稳定性，这允许使用更短的夹板，同时对线性ssDNA部分施加更小的应力。此外，当夹板链紧密靠近时，发夹结构相互静电排斥，促进分子内连接并阻止分子间寡聚复合物的形成。作者测试了一系列具有不同ssDNA区域和发夹环长度的夹板尺寸，发现具有12 nt结合区域和4-8 nt发夹环的夹板性能最佳，允许环化短至16 nt的环。此外，尽管之前的方案发现增加线性DNA的起始浓度会增加分子间连接，但发夹夹板设计允许随着DNA浓度的增加而提高效率，当DNA浓度为100 μM时效率高达97%，相比之下，从1 μM开始时效率为55%。
最近的研究利用DNA适配体来促进连接，以替代传统的DNA夹板设计。在Yan等人的一项研究中，开发了一种含有多个发夹和茎环结构的DNA适配体，用作长度为37、47、67、87和107 nt的线性DNA环化的模板。研究发现，所有环长度的选择性都很高（>94%），而产率随着环长度的增加而降低（37-107 nt的产率分别为96、93、90、83和70%）。作者使用该方法生产了一种环状DNA酶，称为cEC1，当其被大肠杆菌激活时，可以切割荧光RNA报告基因，并用于检测103个细胞/mL的浓度。然而，这种设计的一个缺点是，它需要相对较长的互补序列（27 nt）来结合适配体，这限制了能够生产的最小环尺寸。
迄今为止描述的使用单个线性DNA前体和夹板的程序通常限于约28-150 nt的环尺寸，这主要是由于当前自动DNA合成仪的限制，无法生产更长的序列。为了克服这个问题，Sui等人开发了一种使用多个夹板和短ssDNA片段合成长达452 nt的环状ssDNA的策略。作者发现，逐步添加试剂可以提高选择性和产率，如先前研究所确定，并且该方法具有高选择性和产率，范围为35-46 mol%。然而，当尝试环化大于500 nt的线性DNA时，产率显着下降。这是由于短ssDNA序列之间形成二级中间结构（如发夹）抑制了反应。此外，末端具有发夹中间体的ssDNA可以连接到不受夹板引导的序列，形成非预期的结构。解决这些问题的研究仍在进行中。从应用的角度来看，基于T4连接酶的策略对于CRISPR生物传感特别有吸引力，其中天然的磷酸二酯键和高序列保真度对于最小化背景激活至关重要，尽管可能需要额外的纯化步骤来确保自催化CRISPR系统具有足够的纯度。
2.2.2. 基于CircLigase、RNA连接酶、LAMA和切口连接的方法
除了T4连接酶，替代的连接酶如CircLigase、T4 RNA连接酶和HIFI Taq DNA连接酶也已用于合成环状DNA，其中CircLigase是文献中最常用的。CircLigase，也称为TS2126 RNA连接酶1，由Blondal等人首次分离，是一种中等耐热性酶，最佳温度活性为65oC。CircLigase的一个主要优点是它不需要夹板来促进线性DNA末端的连接。CircLigase的耐热特性使其在线性链中存在二级结构的合成中具有吸引力，因为较高的温度反应有助于去除这些结构，促进更有效的连接。RNA连接酶通过催化ssDNA或ssRNA的5'-磷酸和3'-羟基末端之间在ATP依赖的反应中形成磷酸二酯键来工作。与T4 DNA连接酶类似，T4 RNA连接酶在37oC时表现出最佳活性。应该注意的是，对于DNA环的合成，T4 RNA连接酶的连接效率低于DNA T4连接酶。Sakhabutdinova等人使用T4 RNA连接酶合成了50 nt最佳长度的DNA环，但发现环化效率约为1-2%，尽管用PEG-4000增强了反应条件。Blondal等人证明TS2126 RNA连接酶1的比活性比其它市售RNA连接酶（分别为T4 RNA连接酶和RM378）高约10-30倍，并且可以合成长度从18到85 nt的ssDNA环。Seidl和Ryan发现，对于合成长达117 nt的环，与T4 DNA连接酶相比，产率类似提高，形成的多聚体更少。
通常，将线性DNA长度增加到100 nt以上会导致CircLigase的产率显着下降。为了克服这个问题，Li等人开发了一种方法来提高CircLigase生产的环长度，方法是使用线性DNA，该DNA在5'和3'末端附近含有互补序列，这些序列彼此杂交，形成由线性dsDNA片段连接的ssDNA环，末端有短突出。用CircLigase连接后，杂交的线性结构被外切核酸酶（ExoI和ExoIII）消化，留下完整的ssDNA环。这提高了CircLigase的效率，并将长达517 nt的环的产率从<32%提高到>75%。描述用CircLigase环化短于18 nt的ssDNA的报告很少，然而，由于环尺寸的下限由DNA主链的张力决定，预计其具有与T4连接酶环化类似的限制。
市售CircLigase的另一个限制是其高成本，这促使研究人员探索替代解决方案或合成他们自己的TS2126酶变体。后者使研究人员能够优化蛋白质，潜在地提高产率和效率。例如，Ma等人开发了一种基于TS2126的优化耐热ssDNA连接酶，通过修改其表达的密码子，从16-60 nt长度的线性DNA适配体合成环状DNA适配体，环化活性>65%。尽管没有与标准CircLigase或T4 DNA连接酶进行比较，但新开发的酶比T4 RNA连接酶具有显着更高的环化效率。需要进一步的研究来识别和验证更便宜的CircLigase替代品。
双链DNA环也已使用另一种称为Taq DNA连接酶的市售酶生产，该过程称为连接酶辅助小环积累（LAMA）。LAMA方案旨在生产模仿自然界中发现的染色体外环状DNA（eccDNA），并且在诸如滚环扩增和转录等应用中特别有用。LAMA过程允许研究人员直接从两个线性dsDNA片段开始生产大的dsDNA环。该过程首先涉及两个dsDNA片段的变性，这些片段在半区域中彼此互补，方向相反。然后互补链经历重复的变性和退火循环，最终导致形成具有两个长突出区域的dsDNA，然后可以形成环化结构，留下短"切口"区域。然后使用Taq DNA连接酶连接切口，形成最终的dsDNA环结构。
LAMA方法由Du等人于2008年首次描述，用于制备长度从84到106 bp的dsDNA环，然而，作者无法生产小于66 bp的环，并依靠T4 DNA连接酶来生产更小的dsDNA环。LAMA协议对于合成大于1 kb的大环特别有益，这对于迄今为止描述的环化方法来说一直是一个主要挑战。在Zou等人的一项研究中，作者描述了一种改进的LAMA方法，使用PCR和HIFI Taq DNA连接酶的切口连接生产长达2.6 kb的环，称为QuickLAMA。这种方法的好处是，它允许研究人员直接从宫颈癌和PC3细胞生产互补的dsDNA片段，然后可以使用QuickLAMA协议形成dsDNA环，并最终应用于环化序列内各种靶基因的RCA或RCT。切口连接和Taq DNA连接酶的一个限制是它只连接dsDNA中的切口，需要类似于T4连接酶与夹板的dsDNA底物。LAMA程序的一个进一步限制是它需要dsDNA起始片段和用于变性和退火步骤的专用热循环设备。CircLigase和基于LAMA的方法产生更长或无夹板环状构建体的能力使其非常适合RCA/RCT和生物工程应用，尽管成本、酶的可及性和热要求可能限制它们在即时诊断环境中的采用。
2.3. DNA环合成的化学方法
化学连接是生产环状DNA的已建立的酶促连接替代方法。化学连接环状DNA已被描述使用各种化学品，从溴化氰（BrCN）、铜基双点击化学和双酰亚胺连接。
2.3.1. 基于BrCN的化学连接
使用BrCN连接是一种广泛使用的生产环状DNA的化学方法。该方法通常依赖于与DNA夹板链形成双链体或三链体结构，以将靶链上的3'和5'末端拉近，然后进行BrCN处理连接。BrCN连接优于其他方法的一个优点是，它可以用天然官能团（如羟基和磷酸盐）进行，并且这些基团在3'或5'末端之间可互换而不影响连接效率。然而，线性链在连接位点需要嘧啶富集区域，而夹板DNA中需要嘌呤富集区域。
在Rubin等人的一份报告中，作者使用BrCN连接与三螺旋夹板样模板合成了长度为42、58和74 nt的DNA环。在该策略中，作者发现使用较短的线性前体然后二聚化为全长序列比合成全长寡核苷酸产生更好的线性前体产率（48%）。然后作者使用所示的三链夹板结合策略化学连接DNA形成环，总效率约为10-25%。凝胶提取后的总产率较低，42、58和74 nt DNA环的产率分别为16%、11%和16%。作者还使用多个较小的前体DNA（16和18 nt）制作了34 nt的更小的环，该策略再次产
