《Frontiers in Tropical Diseases》：Development and validation of a novel multiplex mPCR assay for the detection of Anaplasma, Babesia, and Theileria in captive wild ungulates
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野生有蹄类动物是蜱传血液寄生虫的重要宿主，传统镜检方法难以准确检测其混合感染与低水平寄生。为提升诊断效率，研究人员针对无形体（Anaplasma）、巴贝斯虫（Babesia）和泰勒虫（Theileria）开发了一种基于16S rRNA和18S rRNA基因的多重PCR（mPCR）检测方法。该研究在巴基斯坦旁遮普地区的圈养印度瞪羚（Gazella bennettii）和豚鹿（Axis porcinus）中应用此方法，结果显示总感染率达65%，其中无形体感染率为25%，泰勒虫为40%，巴贝斯虫未检出。该方法为野生动物血液寄生虫的同步、早期、准确检测提供了有力工具，有助于减少抗生素滥用、控制耐药性并保护濒危野生有蹄类动物。
蜱虫不仅是令人烦恼的小吸血鬼，更是众多病原体的“致命快递员”。在野生有蹄类动物（如鹿、野牛等）中，由蜱虫传播的血液寄生虫，如无形体（Anaplasma）、巴贝斯虫（Babesia）和泰勒虫（Theileria），是严重威胁其健康的重要病原。这些微小的入侵者寄生在红细胞或白细胞内，导致动物出现发热、贫血、消瘦乃至死亡，不仅影响野生动物种群的生存，也可能通过蜱虫叮咬或环境媒介，波及家畜甚至人类健康，构成了“人-兽-环境”健康交织的复杂挑战。
传统的寄生虫检测主要依靠显微镜观察吉姆萨染色的血涂片。然而，这种方法犹如“大海捞针”，对操作者经验依赖度高，且难以有效识别低水平感染和多种病原体的混合感染（co-infections）。对于生活在动物园、野生动物园等圈养环境中的珍稀有蹄类动物而言，频繁采血进行检测既不合乎动物福利，也面临诸多操作困难。因此，开发一种快速、灵敏且能一次性筛查多种病原体的诊断工具，对于实现野生动物疾病的早期预警、精准治疗和种群保护至关重要。
为应对这一挑战，来自巴基斯坦的研究团队在《Frontiers in Tropical Diseases》期刊上发表了一项研究，致力于开发并验证一种新型的多重聚合酶链式反应（multiplex PCR, mPCR）检测方法，旨在同步检测圈养野生有蹄类动物血液中的无形体、巴贝斯虫和泰勒虫。
研究方法概览
研究人员从巴基斯坦旁遮普省多个动物园和野生动物公园中，采集了60份圈养印度瞪羚（Gazella bennettii，属牛科）和豚鹿（Axis porcinus，属鹿科）的血液样本。他们首先进行了传统显微镜检查作为初筛。随后，基于病原体属的特异性基因——无形体的16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA, 16S rRNA）基因，以及巴贝斯虫和泰勒虫的18S核糖体RNA（18S rRNA）基因，设计了三对特异性引物。通过单重PCR验证引物特异性后，进一步优化反应条件，建立了可在一个反应管内同时扩增三种病原体DNA的多重PCR体系，其目标产物大小分别为：无形体318碱基对（base pairs, bp），巴贝斯虫479 bp，泰勒虫148 bp。最后，通过凝胶电泳观察特异性条带，并对部分PCR产物进行测序验证。
研究结果
3.1 显微镜检查结果
在60份样本中，显微镜检发现40份（66.66%）呈寄生虫阳性。其中，35份为单一感染（无形体9份，巴贝斯虫4份，泰勒虫22份），5份为混合感染。
3.2 单重与多重PCR的特异性
研究首先通过单重PCR验证了各对引物的特异性，分别成功扩增出了无形体（318 bp）、巴贝斯虫（479 bp）和泰勒虫（148 bp）的特异性条带，且无非目标扩增。
随后，研究人员将三对引物组合，成功建立了双重和多重PCR体系。双重PCR验证了任意两种病原体引物组合扩增的可行性。最终的三重PCR在单一反应中清晰地同时扩增出三种不同大小的目标条带，证明了该mPCR体系的可行性。
3.3 多重PCR的灵敏度与测序验证
该mPCR体系的检测灵敏度达到3×102ng。对扩增产物的测序分析显示，其序列与GenBank数据库中相应的无形体16S rRNA、巴贝斯虫18S rRNA和泰勒虫18S rRNA参考序列具有100%的一致性，进一步证实了方法的特异性。
3.2.2 野外样本中混合感染的检测
将建立的mPCR方法应用于40份镜检阳性的野外样本（20份印度瞪羚，20份豚鹿）进行检测。总体病原体检出率为65%，其中无形体感染率为25%，泰勒虫为40%，巴贝斯虫未检出。在两种动物中均检测到了无形体与泰勒虫的混合感染案例。例如，在印度瞪羚样本C11和C19，以及豚鹿样本H9中，均同时检出了无形体和泰勒虫的特异性条带。
结论与讨论
本研究成功开发并验证了一种针对无形体、巴贝斯虫和泰勒虫的新型多重PCR检测方法。该方法在圈养野生有蹄类动物样本中展现出良好的应用效果，其检测结果与单重PCR一致，并通过测序得到确认。研究发现，在巴基斯坦旁遮普地区圈养的印度瞪羚和豚鹿中，血液寄生虫总体感染率较高（65%），以泰勒虫和无形体为主，并存在混合感染情况，而巴贝斯虫在本研究样本中未检出。
该研究的核心意义在于，所建立的mPCR assay（检测方法）为解决野生动物血液寄生虫诊断难题提供了一种高效、准确的工具。相比于传统镜检，它具有更高的灵敏度、特异性，且能一次性鉴别多种病原体，尤其适用于样本获取困难、需尽量减少动物应激的野生动物保护场景。这一技术有助于实现对蜱传血液寄生虫病的早期、快速诊断，从而为及时、精准的治疗干预提供依据，对于控制野生动物种群内疾病传播、减少因误诊导致的抗生素滥用（从而减缓抗生素耐药性）、以及保护濒危野生有蹄类动物具有重要意义。此外，由于无形体、巴贝斯虫和泰勒虫均为人兽共患病原，该研究也凸显了在“一体化健康”（One Health）框架下，加强对野生动物病原监测、防范人兽共患病跨物种传播的重要性。研究的局限性包括样本量相对较小且仅来源于圈养种群。未来需要扩大样本量和地理范围，并探索气候变化等因素对蜱媒及疾病传播动态的影响，以更全面地评估和管理相关风险。
