《Frontiers in Immunology》：Circular mRNA against CleanCap linear mRNA vectors: comprehensive comparison, expression, active and passive immunization
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本研究针对线性与环状mRNA疫苗载体缺乏系统比较的现状，系统评估了不同加帽方式（CleanCap/ARCA）、核苷修饰（N1-甲基假尿苷）及IRES（CVB3/HRVB6）对表达效率、免疫原性及保护效力的影响。结果表明，CleanCap-mΨ线性载体在短期高表达及免疫保护方面最优，而环状载体展现长效表达潜力，为mRNA疫苗平台选择提供了关键数据支撑。
随着mRNA疫苗在抗击新冠疫情中展现出巨大成功，全球科学家正致力于优化这一技术平台的每一个细节。目前主流的线性mRNA疫苗通常依赖5'端帽子结构（Cap）和3'端poly(A)尾来启动翻译，并通过将尿苷（U）替换为N1-甲基假尿苷（m1Ψ）来降低免疫原性并增强稳定性。然而，线性mRNA固有的不稳定性限制了其长效表达。与此同时，环状mRNA（circRNA）作为一种新兴平台，因其无外露末端、能抵抗核酸外切酶降解而备受关注，被认为可能提供更持久的蛋白表达。尽管两种平台各有拥趸，但学界一直缺乏在统一标准下，系统比较线性mRNA（采用最新第三代加帽技术）与环状mRNA（采用不同IRES）在蛋白表达、免疫原性及保护效力上的优劣。发表在《Frontiers in Immunology》上的这项研究，正是为了填补这一空白。
为了回答上述问题，研究团队构建了多种mRNA载体进行“头对头”比较。线性载体采用经典的α-珠蛋白UTR，并设置了不同加帽策略（第三代CleanCap AG与第一代ARCA）及核苷修饰（U与m1Ψ）。环状载体则采用PIE自剪接系统，并对比了两种内部核糖体进入位点（IRES）：常见的柯萨奇病毒B3（CVB3）IRES和一种较少被研究的鼻病毒B6（HRVB6）IRES。研究首先在HEK-293细胞中进行了长达120小时的荧光素酶表达动力学监测，随后在BALB/c小鼠模型中评估了基于SARS-CoV-2 S糖蛋白的疫苗诱导中和抗体及抵抗病毒攻击的能力。
关键技术方法
研究采用体外转录合成线性与环状mRNA。线性mRNA通过共转录加帽（ARCA或CleanCap AG）并优化UTR（α-珠蛋白）；环状mRNA通过PIE自剪接系统连接IRES（CVB3或HRVB6）并利用T4 RNA连接酶环化。利用脂质纳米颗粒（LNP）包裹mRNA，通过体外细胞转染（HEK-293）和体内小鼠（BALB/c）免疫实验，结合ELISA、假病毒中和试验及攻毒实验，系统评估表达 kinetics、免疫原性与保护效力。
2.1 载体构建与表征
研究成功构建了六种不同的mRNA载体（图1）：
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线性载体：包含T7启动子、α-珠蛋白UTR、SARS-CoV-2 S基因（或荧光素酶基因）及poly(A)尾。根据起始核苷酸（GG或AG）分别兼容ARCA或CleanCap AG加帽试剂。部分载体中的尿苷被替换为N1-甲基假尿苷（m1Ψ）。
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环状载体：包含T7启动子、5'和3'端的permuted intron-exon（PIE）序列、IRES（CVB3或HRVB6）及S基因（或荧光素酶基因）。通过T4 RNA连接酶环化，并经RNase R处理去除线性杂质。
所有转录本均通过凝胶电泳和吸光度比值验证了完整性和纯度。
2.2 体外表达动力学：线性m1Ψ载体早期爆发力强，环状载体表现稳健
在HEK-293细胞中的荧光素酶表达动力学曲线（图2，表1）揭示了显著差异：
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线性m1Ψ载体：展现出极高的早期表达峰值。CleanCap-m1Ψ载体在24小时达到顶峰（约47万RLU），显著高于ARCA-m1Ψ载体（约18.5万RLU），凸显了第三代加帽技术的优势。
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线性U载体：表达量极低且衰减迅速，证实了m1Ψ修饰对稳定性和翻译效率的关键作用。
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环状载体：表达峰值虽低于线性m1Ψ载体（HRVB6 IRES约6.8万RLU，CVB3 IRES约2.9万RLU），但衰减更为缓慢，在120小时仍维持较高水平，体现了其长效表达的潜力。HRVB6 IRES的表现优于CVB3 IRES。
2.3 体内生物发光成像：验证体外趋势
小鼠体内成像结果（图3，表2）与体外数据高度一致。线性CleanCap-m1Ψ载体在注射后24小时信号最强，但72小时即大幅下降。环状载体信号虽较弱，但在72小时仍清晰可见，再次证明了其表达持久性。
2.4 S蛋白表达与免疫原性：线性载体诱导更强抗体应答
将载体编码基因换为SARS-CoV-2 S糖蛋白后：
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体外表达：线性CleanCap-m1Ψ-S载体在细胞裂解液和上清中检测到的S蛋白含量最高，环状载体次之（图4）。
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小鼠免疫：两次免疫后，线性CleanCap-m1Ψ-S诱导的中和抗体滴度（pVNT50）最高，是环状HRVB6-S组的约3倍，环状CVB3-S组的约6倍（图5A）。值得注意的是，环状载体在首剂后14天诱导的抗体水平与线性载体相当，但在加强免疫后未能实现同等程度的爆发（图5B）。
2.5 攻毒保护：线性载体提供完全保护
在SARS-CoV-2 Delta变异株攻毒实验中（图6）：
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线性CleanCap-m1Ψ-S组：所有小鼠均存活，肺部病毒载量极低，病理损伤最轻。
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环状载体组：部分小鼠出现体重下降，肺部病毒载量显著高于线性组，保护效力不完全。
结论与讨论
本研究系统比较了优化后的线性mRNA与环状mRNA平台。结果表明，采用CleanCap AG加帽和m1Ψ修饰的线性mRNA在蛋白表达水平、免疫原性及保护效力上均显著优于环状mRNA。其快速的蛋白爆发式表达对于激活强效免疫应答至关重要。尽管环状mRNA（尤其是HRVB6 IRES）展现了更持久的表达特性，但在当前技术下，其免疫原性和保护效力仍不足以匹敌优化后的线性平台。研究为疫苗开发者在载体选择上提供了关键依据：若追求快速、强效的免疫保护，优化线性mRNA仍是首选；环状mRNA的长效表达潜力则可能在需要长期蛋白表达的疗法（如酶替代疗法）中更具价值。未来环状mRNA技术的突破可能依赖于发现更高效的IRES或优化环化策略。
