《Frontiers in Immunology》：If you give a mouse a poopsicle: a novel fecal microbiota transplant method for exploring the role of the gut microbiome in stress-related outcomes in mice
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本文针对传统小鼠FMT口服灌胃（oral gavage）引发应激、干扰肠-脑轴研究的问题，开发了自愿食用的冷冻粪便悬液“poopsicle”法，并优化了VNAA抗生素方案。结果显示该方法能有效移植微生物、降低血浆皮质酮（corticosterone），为应激研究提供了低压力的可靠工具。
在生命科学研究中，肠道微生物群（gut microbiome）与大脑之间的双向交流——即“微生物-肠-脑轴”（microbiome-gut-brain axis），已成为解释压力相关障碍（stress-related disorders）发病机制的重要视角。越来越多的临床关联研究表明，肠道微生物组成的改变与抑郁症、社交焦虑症及创伤后应激障碍等精神类疾病密切相关。然而，人类研究大多只能提供相关性证据，难以厘清因果关系。为了突破这一瓶颈，研究人员广泛采用粪便微生物群移植（Fecal microbiota transplantation, FMT）技术，将特定供体的肠道菌群移植到受体啮齿动物（如小鼠）体内，从而在体内模型中验证微生物群对宿主行为及生理状态的因果影响。
尽管FMT是研究肠-脑轴的有力工具，但目前临床前小鼠模型中最常用的移植递送方式仍是口服灌胃（oral gavage）。这种方法需要研究人员强行固定小鼠，并通过金属灌胃针将菌液直接推入胃部。这一过程本身是一种显著的急性应激源，会在操作后30分钟内大幅升高小鼠体内的应激激素——皮质酮（corticosterone，啮齿动物的糖皮质激素）水平。这种处理诱导的生理应激不仅会损害动物福利，更可能混淆与压力相关的行为学读数（如焦虑、抑郁样行为），甚至可能导致部分研究中FMT后行为变化不显著。此外，传统的FMT流程中还涉及使用抗生素清除受体小鼠的原生肠道菌群，以促进移植微生物的定植。常见的含甲硝唑（metronidazole）的抗生素鸡尾酒（如VNAM）往往因味道极苦导致小鼠拒饮，引发脱水、体重骤降，同样构成额外的应激与混杂因素。因此，开发一种低压力、标准化且能有效移植肠道菌群的小鼠FMT实验方案，对于提升肠-脑轴，尤其是应激相关研究的严谨性与可重复性至关重要。
为此，Monica A. Tschang、Ronin Deo-Campo Vuong、Baylee Eilers等研究人员开展了一系列方法学优化与验证实验，旨在建立一套最大限度减少治疗诱导应激的FMT流程。他们的研究论文发表在《Frontiers in Immunology》。首先，团队通过双瓶选择实验和行为学测试筛选出了一种不含甲硝唑、适口性好的抗生素组合（VNAA：万古霉素vancomycin、新霉素neomycin、氨苄青霉素ampicillin和两性霉素-β amphotericin-β），既能有效清除肠道微生物DNA，又不会引起体重下降或焦虑样行为。其次，他们创新性地开发了名为“poopsicle”（便便冰棒）的冷冻粪便 aliquots 制备方法：将供体粪便与含甘油的脑心浸液（Brain Heart Infusion, BHI）培养基及DietGel Recovery 按特定比例均质化，分装冷冻；受体小鼠会在习惯化后自愿食用这些冷冻团块，从而完成FMT。研究结果显示，与口服灌胃相比，接受“poopsicle”FMT的小鼠血浆皮质酮水平显著更低；且通过16S rRNA扩增子测序和浅层宏基因组测序评估，受体小鼠在FMT结束1周后，其微生物特征（基于Bray-Curtis β多样性距离）与供体粪便极为相似，这种定植效果可持续长达6周。综上所述，该研究成功建立了一套低压力、高效且易于实施的小鼠FMT实验范式，为精准探究肠道菌群在应激及相关神经精神疾病中的作用提供了重要的方法论支撑。
为开展上述研究，作者主要运用了以下关键技术方法：使用9-11周龄雄性C57BL/6J小鼠（来自Jax，饲养于美国退伍军人事务部普吉特湾医疗保健系统），通过双瓶选择实验筛选抗生素适口性；利用旷场实验（Open field test）评估抗生素诱导的焦虑样行为；制备供体粪便冷冻悬液（“poopsicle”，含BHI培养基、30%甘油及DietGel Recovery）及车辆对照；通过自愿进食或传统口服灌胃（22G金属针）进行FMT递送；使用浅层宏基因组测序（Diversigen Inc.）和16S rRNA V3-V4区扩增子测序（华盛顿大学mim_c中心）分析肠道菌群组成；采用ELISA试剂盒检测血清皮质酮（corticosterone）水平；并进行厌氧平板培养以验证厌氧菌活性。
3.1 Mice maintain body weight during VNAA exposure and do not differ from water controls
通过对多种抗生素方案（VNAM、VNAA、VNBP）的比较，研究发现含甲硝唑的VNAM组小鼠因厌饮在6天内体重下降超过20%，而去除甲硝唑的VNAA组与另一种方案VNBP组体重均增长。在双瓶选择实验中，小鼠更倾向于饮用VNAA而非VNBP。此外，单独给予VNAA一周的组与给予普通水的对照组相比，无论是对体重维持的百分比还是按体重标准化的液体消耗量均无显著差异。这表明VNAA是一种在体重维持和饮水量上与水别无二致的、可行的抗生素方案。
3.2 VNAA effectively depletes fecal microbes and does not induce anxiety-like behavior
在旷场实验中，VNAA组与饮水对照组在总移动距离和中心区域停留时间上无显著差异，说明VNAA未诱发焦虑样或运动缺陷行为。微生物DNA浓度检测显示，VNAA能显著消耗粪便中的微生物DNA。进一步比较4天与7天的VNAA给药时长发现，两者均能消耗微生物DNA，但4天组在抗生素停服一周后的粪便DNA恢复量显著高于7天组。因此，4天的VNAA方案既能有效清空原生菌群以利于定植，又有利于后续微生物群的恢复，被选用为后续实验标准。
3.3 Frozen FMT aliquot preparation maintains anaerobic bacteria populations
由于“poopsicle”制备过程处于有氧环境，研究者验证了该过程是否能维持严格的厌氧菌。将原始粪便与制成的冷冻FMT aliquots分别进行厌氧培养并测序。结果显示，原始粪便与冷冻aliquots的DNA浓度、α多样性（Shannon index）及厌氧培养后的微生物组成均无显著差异，且DietGel本身几乎不含可检测细菌DNA。这表明在有甘油保护的均质化与冷冻过程中，厌氧微生物群落得到了很好的维持。
3.4 Delivery via frozen aliquots results in less circulating corticosterone than via oral gavage
研究者设置了仅抗生素组、冷冻车辆aliquots组（模拟FMT载体，无粪便）和口服灌胃车辆 slurry组，并在最后一次处理后30分钟采血测皮质酮。结果显示，口服灌胃组的皮质酮浓度显著高于仅抗生素组，而冷冻aliquots组与仅抗生素组无差异，且略低于灌胃组（边缘显著）。这证明“poopsicle”自愿进食法相较于传统灌胃，极大减少了FMT递送本身引发的生理应激反应。
3.5 Microbiomes of mice receiving frozen FMT aliquots shift toward the donor
为验证FMT效率，供体小鼠被给予高脂高糖（high-fat/high-sugar）饮食以改变菌群，制成FMT “poopsicle”。受体小鼠先经4天VNAA清空，随后接受FMT1（连续3天FMT+1次加强）或FMT3（连续3天FMT+3次加强）方案。通过Bray-Curtis距离和主坐标分析（PCoA）发现，FMT1和FMT3组的微生物组在FMT后1周最接近供体冷冻aliquots，且这种相似性在FMT3组中可持续至第6周；而抗生素对照组（AB control）则始终保持距离。这证实了该“poopsicle”方法能有效、持久地将受体微生物组重塑为供体特征。
在讨论与结论部分，作者指出，本研究成功开发并验证了一种低压力的FMT协议，极大改善了肠-脑轴，特别是应激相关研究的实验条件。通过剔除味道苦涩且能穿过血脑屏障的甲硝唑，VNAA鸡尾酒在不引起厌饮、体重减轻或焦虑行为的前提下，有效耗竭了肠道微生物（包括厌氧菌），且4天的短疗程平衡了耗竭效果与后续菌群恢复的需要。更为核心的是，“poopsicle”自愿进食法彻底规避了口服灌胃带来的束缚应激与可能的组织损伤，使得血浆皮质酮水平不再受递送方式的干扰。同时，该方法无需专门的厌氧培养设施即可在普通实验室完成，且移植后的微生物特征能稳定维持数周。尽管本研究仅使用了雄性小鼠且供体粪便为混合样本，作者也提出了未来的改进方向（如加入雌性小鼠、单供体高分辨率宏基因组追踪等）。总而言之，这种低成本和低压力的“便便冰棒”FMT方法，不仅提升了动物福利，更排除了束缚递送对神经生物学读数的混淆，强化了微生物-肠-脑轴研究中因果推断的可靠性，为压力与肠道菌群领域的实验设计提供了优秀的模板。
