《Journal of Bioresources and Bioproducts》：Closing Loop: Systems-Level Integration of Synthetic Consortia and Process Engineering for Lignocellulosic Microbial Lipid Biomanufacturing
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这篇综述围绕木质纤维素微生物油脂生物制造，系统论述了如何通过整合预处理化学、合成生物学菌株工程、人工微生物菌群、数据驱动策略和过程工程，来应对生物质抗降解性、抑制物毒性和下游工艺挑战，从而构建经济可行、低碳的下一代生物炼制路线图。文中重点剖析了CRISPR/Cas9、RNA干扰等工具在精准调控代谢流中的应用，以及机器学习、技术经济分析在弥合实验室成果与工业化差距方面的潜力。
1. 引言
在全球能源需求激增、化石燃料储备枯竭以及CO2排放对气候影响加剧的背景下，寻找可持续的替代能源显得尤为迫切。虽然源自植物糖的生物燃料是一个可行选项，但其与粮食作物的竞争引发了严重的粮食安全问题。相比之下，源自农业残留物和能源作物的木质纤维素生物质，因其丰富、经济且不与粮食供应冲突的特性，成为一种极具潜力的替代原料。其价值不再局限于单一产物，而是能够支持生物燃料、平台化学品和功能材料等多种产物的集成与可持续生产。近年来，生物炼制设计的进步使得可以选择性地将其三大主要组分——纤维素、半纤维素和木质素——分离并转化为特定的高价值产品。然而，将这种顽固性资源转化为微生物油脂的商业可行性，仍然受到零散单元操作（特别是生物质解构效率与下游抑制物毒性之间的权衡）的限制。本文超越线性的技术总结，提出了下一代生物炼制的集成路线图。
2. 木质纤维素生物质转化技术
2.1. 解构抗降解屏障：结构限制与预处理创新
木质纤维素生物质是地球上最丰富的可再生资源，是发酵糖的低成本储备库。然而，开发其潜力受制于其固有的抗降解性，这种特性源于其复杂的进化结构，旨在抵抗降解。如Fig. 1所示，生物质基质由三种主要聚合物组成：纤维素（30%–60%）、半纤维素（15%–40%）和木质素（10%–30%）。纤维素是β-1,4连接的D-葡萄糖单元的线性均聚物，形成由氢键稳定的结晶微纤维，赋予其高结晶度和对酶水解的抗性。半纤维素是一种由木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖组成的支链杂聚物，结构有序性较低，便于水解。木质素是一种由愈创木基（G）、紫丁香基（S）和对羟基苯基（H）单元组成的不规则芳香族聚合物，形成疏水屏障，阻碍酶接触。在木质纤维素基质中，纤维素提供结构完整性，半纤维素充当交联剂，木质素通过包埋碳水化合物聚合物来增强刚性。这种抗降解结构虽然保护植物免受环境胁迫，却给生物质解构带来了重大挑战。各种解聚技术虽然可增强可及性，但常常产生抑制性化合物，主要是呋喃（如糠醛和羟甲基糠醛（HMF））、弱酸和酚类物质，这些物质会降低微生物活力并减少可发酵糖的产量。有效的转化需要破坏木质纤维素基质以促进更好的酶-底物相互作用，这使得预处理成为生物炼制工业化的关键步骤。
因此，预处理的目的不仅仅是减小尺寸，而是有针对性地破坏这种木质素-碳水化合物复合体。有效的预处理能破坏木质素酚醛基质、半纤维素交联和结晶纤维素结构，从而提高酶的可及性。预处理方法包括物理、化学、生物或物理化学方法，旨在改变木质纤维素的结构和组成特征以增强其消化率。物理方法提高了糖的释放，但可能使耐热污染物存留。化学预处理通过溶解或改性木质素来提高水解效率，但极端pH条件会产生抑制性副产物，如糠醛，对微生物生长产生负面影响。酸性低共熔溶剂（DES）由于其可回收性和环境相容性，已成为有前途的绿色预处理剂。例如，氯化胆碱-甲酸DES通过高效溶解木质素，使稻草和油棕空果串的糖得率达到80%–82%，且仅产生0.2–0.3 g/L酚类抑制物，这一特性确保了与产油酵母Yarrowia lipolytica的良好相容性。然而，富含乙酸的DES会抑制Rhodotorula glutinis的生长，这凸显了明智选择溶剂组分的重要性。更重要的是，木质纤维素预处理技术对微生物油脂产量具有决定性的下游影响（而不仅仅是糖产量），因为它们固有的差异决定了所产生的抑制性副产物的类型和浓度。生物预处理在温和、环保的条件下运行，可有效解聚木质纤维素，但通常受限于缓慢的动力学和污染风险。因此，优化需要在转化效率和污染控制之间取得平衡，通过最小化抑制物形成、采用灭菌或耐受抑制物的菌株以及整合分阶段工艺（例如预处理后快速发酵）来实现。方法选择应与原料特性、目标产品和可持续性目标相一致：酸法或混合预处理适用于最大化糖得率，而生物法或低酸法支持更绿色的工艺。此外，集成策略，如通过活性炭吸附或生物修复去除抑制物、工程化耐胁迫微生物、以及将糖化与发酵耦合（SSF），可以进一步提高效率和成本效益。
2.2. 协同酶鸡尾酒和解毒方法以克服木质纤维素到糖转化中的水解效率障碍
然而，在天然的木质纤维素材料中，木质素通过酯键和醚键与多糖共价连接，而疏水相互作用进一步限制了酶的可及性，导致高纤维素结晶度（60%–70%）和低孔隙率（< 30%）。稀酸水解、蒸汽爆破（SE）或碱性氧化等预处理方法可以破坏这些连接，将结晶度降低至40%–45%，并将孔隙率提高至55%–70%，从而增强酶对纤维素的可及性。在酶水解过程中，协同的多酶系统以时空方式运作：内切-β-1,4-葡聚糖酶切割无定形纤维素产生还原末端，外切-β-1,4-葡聚糖酶释放纤维二糖单元，β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖，减轻产物抑制。互补的半纤维素酶进一步提高了糖化效率。尽管取得了显著进展，酶生产和应用的高成本仍然是大规模实施的主要瓶颈。
为了应对这一挑战，近期的努力集中在两个主要策略上：通过遗传和工艺优化提高酶生产率并降低酶负载量，以及改善酶的回收和再利用。例如，特定水解酶的共表达显著改善了纤维素水解和乙醇得率，而酸-热水预处理通过降低木质素含量增加了纤维素可及性。酶挖掘的进展也为降低成本提供了新机会；通过宏基因组测序和功能验证，已从堆肥中回收了耐热糖苷水解酶。然而，酶回收仍面临实际挑战，如不可逆吸附到木质素上、高固含量条件下催化活性降低、副产物抑制以及长时间操作中酶的不稳定性。尽管存在这些限制，已经提出了几种新兴策略来改善酶的回收和再利用，包括酶固定化、膜辅助分离以及开发更稳健、更耐受木质素的酶系统。克服这些问题对于经济可行和可持续的木质纤维素生物炼制至关重要。
通过酶解释放的糖为微生物油脂生产提供了必需的底物；然而，预处理衍生的抑制物，如糠醛和HMF，会严重损害微生物的生长和代谢。糠醛抑制糖酵解和三羧酸（TCA）循环酶，而HMF通过阻断关键的糖酵解步骤产生类似的抑制作用。为了减轻这种影响，开发了三种互补的方法：通过适应性进化或过表达抗性基因进行菌株工程以增强耐受性；使用蒸汽爆破、氨纤维爆破或湿式氧化等方法优化预处理以最小化抑制物形成；以及通过溶剂萃取、离子交换或漆酶处理进行解毒。总之，高效的酶水解与有效的抑制物管理相结合，最大限度地释放可发酵糖，并确保稳健的微生物油脂生物合成，为可持续的木质纤维素生物炼制奠定了基础。
3. 用于油脂合成的微生物
微生物油脂是石油衍生燃料的可再生替代品，在底物利用（包括低成本木质纤维素生物质）和工程化定制油脂谱方面具有多功能性。产油微生物，定义为积累超过细胞干重（DCW）20%油脂的微生物，包括酵母、丝状真菌和某些细菌。每组在油脂积累、组成和工业应用性方面都表现出独特的能力。
3.1. 产油微生物的代谢与调控优化
产油微生物，包括酵母、丝状真菌和某些细菌，在将木质纤维素生物质转化为细胞内油脂（主要是三酰甘油（TAGs））方面展现出显著潜力。其中，产油酵母因其生长快速、稳健和遗传可操作性而被研究得最为广泛。代表性菌株如Y. lipolytica、Rhodosporidium toruloides、Lipomyces starkeyi、Trichosporon cutaneum和Cutaneotrichosporon oleaginosum能有效利用源自木质纤维素生物质水解产物的糖。丝状真菌，如Mortierella alpina、Mortierella isabellina和Aspergillus niger，通过产生多不饱和脂肪酸（PUFAs）和分泌促进直接木质纤维素水解的胞外酶，进一步发挥作用。同时，某些放线菌，包括Rhodococcus opacus、Rhodococcus jostii、Arthrobacterspp.和Acinetobacter baylyi，可以代谢木质素衍生的芳香族化合物，并将碳引导至中性脂质或蜡酯的生物合成。
木质纤维素生物质的微生物油脂生物合成主要由通过中心代谢途径（特别是糖酵解、TCA循环和脂肪酸生物合成）的细胞内碳通量控制。增强流向乙酰辅酶A（acetyl-CoA）和丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）等油脂前体的通量是菌株工程的主要目标。微生物油脂合成通常遵循两条主要代谢途径：de novo和ex novo生物合成。在木质纤维素生物转化背景下，de novo途径占主导地位，因为源自纤维素和半纤维素水解产物的糖通过糖酵解和TCA循环汇集，产生乙酰辅酶A，这是脂肪酸合成的通用前体。在de novo途径中，乙酰辅酶A被乙酰辅酶A羧化酶（ACC）羧化生成丙二酰辅酶A，这是脂肪酸生物合成中关键的限制步骤和决定步骤。随后，合成的脂肪酸通过Kennedy途径组装成TAG，该途径代表了微生物中主要的储存脂质生物合成途径。该途径涉及由甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）和二酰甘油酰基转移酶（DGAT）顺序催化的三个关键酰化反应，其中DGAT是限速酶。
总之，产油微生物的代谢和调控优化集中在加强碳通量流向乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，增强脂肪酸链延伸，以及最大化TAG组装效率。关键策略包括加强糖酵解前体供应、缓解ACC和DGAT等限速步骤，以及微调FAS活性以控制链长和饱和度。系统代谢工程的进步进一步实现了对前体可用性、氧化还原平衡和亚细胞脂质储存的动态调控，从而协调中心代谢与油脂生物合成。
3.2. 将木质纤维素生物质衍生的糖转化为油脂
高效的糖利用和抑制物耐受性是木质纤维素水解产物油脂生产的关键决定因素。主要的单糖，葡萄糖（C6）和木糖（C5），通过包含糖酵解驱动的前体供应和脂肪酸组装的代谢网络汇集到油脂生物合成中。不同的C5/C6糖代谢显著影响油脂产量。葡萄糖通常支持更高的油脂合成，这是由于与其他糖相比，其更快的糖酵解通量和通过柠檬酸信号更有效地激活乙酰辅酶A羧化酶。木糖代谢受到碳分解代谢物阻遏（CCR）的调控。在葡萄糖存在的情况下，葡萄糖被优先同化，木糖利用基因的表达受到CCR因子的抑制。预处理衍生的抑制物进一步加剧了混合糖利用的这些限制，导致木糖代谢效率降低和发酵延迟。为了减轻CCR，策略包括优化葡萄糖与木糖的比例，以及采用启动子工程改变代谢优先级。
此外，产油微生物中的油脂积累还受到营养限制，特别是氮限制的触发。因此，碳氮比（C/N）在启动油脂生物合成中起着关键作用。在氮限制条件下，产油微生物经历代谢重编程以增强乙酰辅酶A的产生。在诸如Y. lipolytica和L. starkeyi等产油酵母中，据报道，氮耗竭会激活腺苷一磷酸（AMP）脱氨酶，导致细胞内AMP水平降低并抑制异柠檬酸脱氢酶活性。这会将通量重新导向柠檬酸，柠檬酸被输出并由ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸。在优化条件下，大部分碳通量可以被引导至脂肪酸生物合成，有助于在油脂积累系统中实现高碳转化效率。
总的来说，从木质纤维素糖高效生产油脂取决于碳通量分布、氧化还原平衡和营养可用性的协调调控。葡萄糖提供快速的前体供应，而木糖的利用仍受CCR和辅因子不平衡的限制。预处理衍生的抑制物在工艺水平上进一步放大了这些限制，这强化了对混合糖利用、氧化还原优化和氮调控耦合的集成策略的需求。
3.3. 将木质纤维素生物质直接转化为微生物油脂
木质纤维素生物质直接微生物转化为油脂是实现可持续生物燃料生产的关键一步。尽管这种原料提供了丰富的可发酵糖供应，但其顽固的结构，尤其是木质素的存在，对直接的酶水解和微生物同化构成了重大挑战。整合生物加工（CBP）已成为一种有前途的策略，它将纤维素酶分泌、木质纤维素水解和油脂积累整合在一个单一的微生物系统中。这种方法绕过了昂贵的多步骤预处理和单独的酶生产，直接将碳从原始生物质引导至油脂前体。
天然具有纤维素分解能力的产油微生物为CBP提供了指导性模型。酵母Cyberlindnera rhodanensisCU-CV7在羧甲基纤维素上分泌多种纤维素酶的同时积累高达DCW 22%的油脂，展示了广泛的底物灵活性。丝状真菌，如Mortierellaspp.和A. niger，通过水解复杂多糖和合成PUFAs进一步发挥作用，在生物质降解和油脂生产方面提供双重功能。
现代代谢工程已显著增强了CBP性能。在Schizochytrium limacinumSR21中，CRISPR-Cas9介导的PEX10缺失阻止了油脂降解，而过表达ACC1和DGAT将油脂含量从DCW的66%提高到77%，DHA和总PUFA分别达到55%和70%。类似地，为pH、C/N比和底物浓度优化的L. starkeyi从木薯淀粉中实现了13.99 g/L的油脂产量，说明了集成水解-油脂合成工艺的潜力。这些例子强调，酶活性、糖代谢和油脂生物合成的协调控制对于从原始生物质实现高产率转化至关重要。
尽管取得了这些进展，在加工真实的木质纤维素生物质方面仍然存在挑战。木质素限制了酶的可及性，并可能使纤维素酶失活，而低效的戊糖利用降低了整体碳转化效率。为了克服这些障碍，合成生物学能够引入异源纤维素酶和优化分泌途径，而适应性实验室进化（ALE）则产生能够耐受生物质衍生抑制物的菌株。机器学习指导的发酵条件优化进一步平衡了酶水解、糖摄取和油脂积累，提高了生产率。
为了实现完整的循环木质纤维素生物炼制，木质素增值必须与油脂生产紧密结合。木质素衍生的芳香族化合物，包括单体酚和羟基肉桂酸酯，可以被专门的微生物或工程化酵母同化以产生油脂或其他高价值生物化学品。或者，木质素流可以通过化学或生物方法升级为高价值产品，抵消工艺成本并提高整体碳效率。将木质素转化与基于糖的油脂生产相结合，创造了更完整的碳利用循环，从而支持生物炼制的经济和环境可持续性。
4. 木质纤维素油脂生物制造的系统代谢工程与过程集成
4.1. 提高油脂产量的代谢策略
将木质纤维素糖转化为油脂依赖于碳和还原力向脂肪酸和TAG生物合成的高效引导。基于上述代谢原理，最近的研究已经确定了可以系统地加以工程化以在木质纤维素条件下提高油脂产量、组成和稳健性的关键代谢控制点。传统的代谢工程通常侧重于过表达单个限速酶。然而，从复杂的木质纤维素水解产物实现高油脂滴度需要一种整体的“推-拉-阻”策略来有效地重新引导碳通量：基因调控、代谢途径优化和菌株进化。
“推”（前体可用性）：第一个瓶颈在于乙酰辅酶A和NADPH的供应。最近的努力集中在重新连接中心碳代谢，以将通量从糖酵解“推”向油脂前体。例如，工程化氧化磷酸戊糖途径或过表达苹果酸酶显著增强了NADPH的再生，这是脂肪酸合酶的关键辅因子。此外，优化“丙酮酸节点”，例如调节丙酮酸脱氢酶旁路，确保了源自混合糖的稳健乙酰辅酶A库。
“拉”（油脂组装）：为了最大化前体“拉”入油脂库，过表达ACC和DGAT仍然至关重要。ACC催化羧化的决定步骤，而DGAT驱动TAG组装的最后步骤。在产油酵母中过表达关键的油脂生物合成酶，包括ACC和DGAT，已被广泛报道可增强油脂积累，油脂含量通常达到DCW的40%–60%，在某些优化氮限制条件下接近~65%。值得注意的是，在Y. lipolytica中异源DGAT/GPAT的共表达不仅增加了油脂滴度，还将脂肪酸谱定制为高价值的PUFAs，如二十碳五烯酸（EPA）。此外，菌株进化策略，如ALE，产生了能够在木质纤维素生物质衍生的胁迫下茁壮成长并有效同化混合糖的稳健表型。
“阻”（堵塞漏洞）：如果不最大限度地减少碳损失，高产率生产是不可能的。“阻”策略针对竞争途径和油脂降解循环的删除。相反，通过敲除参与油脂降解的基因来抑制脂肪分解途径，可以增强油脂生产；TGL4的缺失使Y. lipolytica中的EPA含量增加了57%，有效地将碳锁定在所需形式中。此外，破坏糖原或有机酸形成途径消除了无效循环，将更多的碳引导至TAG生物合成。
赋能技术：CRISPR和AI：这种复杂逻辑的实施正在被下一代合成生物学工具加速。CRISPR/Cas9通过实现多重基因编辑彻底改变了菌株工程，允许同时修改“推-拉-阻”模块，这是传统方法以前无法实现的壮举。此外，AI和机器学习的集成正在成为一个改变游戏规则的因素，尖端的数据驱动方法进一步释放了微生物油脂生产系统的潜力。AI驱动的模型现在可以通过分析海量的多组学数据集来预测非直观的代谢靶点并优化调控网络，以前所未有的精度指导细胞工厂的合理设计。
这些策略已使用实际的木质纤维素原料成功验证。工程化的R. toruloides在高粱水解产物上达到~16.7 g/L油脂，R. babjevae在未解毒的小麦秸秆水解产物上积累~64.8%油脂。在R. toruloides中掺入木质素降解过氧化物酶增强了解毒作用，并将油脂产量提高了20%–30%。M. isabellina直接利用未解毒的玉米芯水解产物实现11.6 g/L的油脂滴度和50%–55%的DCW油脂含量。总之，基因调控、代谢途径优化和菌株进化策略的协调应用极大地推进了木质纤维素生物质向微生物油脂的生物转化。底物抑制、不完全的混合糖利用和下游回收等剩余挑战仍然限制着工业化，但集成的系统和合成生物学方法正在不断缩小这些差距。
4.2. 动态生物过程控制与抑制物管理的适应性策略
预处理衍生的抑制物是木质纤维素生物转化中的核心瓶颈之一。虽然其形成机制在前文已有讨论，但本节重点讨论工艺水平的缓解策略和适应性发酵控制。除了代谢优化，发酵条件强烈影响糖到油脂的转化效率。因此，合适的发酵策略和抑制物缓解方法对于将细胞内改进转化为高工艺水平生产率至关重要。从木质纤维素水解产物进行糖到油脂转化的效率在很大程度上取决于发酵策略。常见模式包括分批发酵（BF）、补料分批发酵（FBF）和连续发酵（CF）。在BF中，所有底物最初供应，没有后续添加，使过程简单但易受底物波动和抑制物影响。FBF增量引入底物，减轻了高浓度抑制，提高了利用率。CF连续供应新鲜培养基并取出培养液，使细胞保持稳态并提高生产率。
总的来说，不同的发酵模式适用于不同的应用场景。BF由于其操作简单，最适合实验室规模的研究和初步菌株评估。FBF对于具有高糖或高抑制物浓度的木质纤维素水解产物特别有利，因为它减轻了毒性，同时实现了更高的油脂滴度，使其成为工业实施的首选模式。CF在受控条件下提供卓越的生产率和工艺稳定性，但其应用受到较高操作复杂性和对污染敏感性的限制，目前主要限于控制良好的工业系统。
除了工艺设计，抑制物耐受性严重影响油脂产量。预处理衍生的呋喃、酚类和弱酸损害微生物代谢。首先，抑制物直接抑制微生物生长。例如，乙酸以其非解离形式扩散到细胞中，解离并使细胞质酸化，抑制蛋白质活性和生长。其次，抑制物干扰底物利用效率。木质纤维素水解产物中的化合物如糠醛和HMF可
