改进的tRNA阵列方法第2版，用于同时体外合成21种tRNA

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Enhanced tRNA array method version 2 for simultaneous in vitro synthesis of 21 tRNAs

本研究针对转运RNA（tRNA）阵列合成中翻译活性不足的问题，通过识别限制性tRNA组（PIEN组），优化序列结构并引入leader序列，开发出tRNA阵列方法2.0，使多款报告蛋白的翻译活性接近单独制备tRNA水平，为自复制基因表达系统构建提供更高效平台。

　　

宫地良太（Ryota Miyachi）|入江安娜（Anna Irie）|市桥纪和（Norikazu Ichihashi）

东京大学文理研究生院生命科学系，日本东京目黑区驹场3-8-1，邮编153-8902

转移RNA（tRNA）在翻译过程中起着至关重要的作用，而其在体外（in vitro）的同时合成仍然是自下而上合成生物学中的一个关键挑战。我们之前开发了一种tRNA阵列方法，该方法能够从单个DNA模板中同时合成21种tRNA；然而，对于某些蛋白质而言，其翻译活性明显低于单独制备的21种tRNA所达到的水平。在这里，我们确定了限制tRNA阵列方法中翻译活性的tRNA组分（PIEN组分），并通过序列修饰以及在阵列构建中加入引导序列来提高翻译活性。改进后的tRNA阵列方法（版本2）生成的tRNA集合能够在翻译耦合和非耦合条件下，实现与单独制备的tRNA相当的翻译水平。这种tRNA合成方案为构建可自我复制的基因表达系统提供了更好的平台。

研究节选

DNA制备

用于制备tRNA变体的DNA模板是通过PCR生成的，所使用的正向寡核苷酸包含T7启动子及相应的tRNA序列，同时还使用了2′-O-甲基修饰的反向引物（表S1）。本研究中使用的tRNA变体序列和引物组合列于表S2中。编码L_PIEN_v2的DNA片段是通过Twist Bioscience（美国加利福尼亚州南旧金山）的人工基因合成服务获得的。

限制性tRNA的鉴定

在我们之前的研究中，我们构建了一种tRNA阵列方法，该方法可以编码翻译所需的全部21种tRNA，这些tRNA来自五个多顺反子基因组，每个基因组中的tRNA基因都是以端到端的方式直接连接的（图1A）。转录后，这五个转录本通过HDVR序列在3′端的自我切割以及RNase P的消化作用生成成熟长度的tRNA产物。

讨论

在本研究中，我们确定了之前研究中建立的tRNA阵列方法中限制翻译活性的tRNA组分，并通过提高tRNA活性和tRNA前处理效率来构建和开发了tRNA阵列方法（版本2）。具体来说，我们发现PIEN组分是所有测量蛋白质翻译的瓶颈；通过稳定tRNA的三叶结构增强了tRNA（尤其是tRNA^Pro）的活性，并对PIEN组分进行了重新设计。

作者贡献声明

宫地良太（Ryota Miyachi）：撰写初稿、资料准备、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构思。入江安娜（Anna Irie）：方法学设计。市桥纪和（Norikazu Ichihashi）：撰写修订稿、审稿编辑、项目监督、资金申请、概念构思。

致谢

作者声明与本手稿无关的利益冲突。本研究得到了日本学术振兴会（JST）、CREST项目（项目编号JPMJCR20S1）以及Kakenhi项目（项目编号22H05402、24H01111和23KJ0815）的支持。