无细胞筛选方法用于检测肽标签在葡萄糖脱氢酶形成液滴状结构过程中的作用

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Cell-free screening of peptide tags for droplet-like assembly formation of glucose dehydrogenase

生物溶剂耐受性GDH酶通过PURE系统筛选肽标签实现液滴组装优化

　　

伊藤原智子（Sayoko Ito-Harashima）| 千田小春（Koharu Alicia Senda）| 川川亚子（Ako Kagawa）| 小林诚二（Seiji Kobayashi）| 村重由纪（Yuki Muroshige）| 松浦智明（Tomoaki Matsuura）| 三浦奈津子（Natsuko Miura）| 片冈道彦（Michihiko Kataoka）

大阪府立大学农学研究生院应用生物化学系，日本大阪市堺区学园町1-1，邮编599-8531

葡萄糖脱氢酶（GDHs）是一类氧化还原酶，能够催化d-葡萄糖氧化为葡糖酮-δ-内酯，在生物传感器、生物电极和生物催化辅因子再生等工业应用中得到广泛应用。特别是依赖于NAD(P)⁺的GDHs常被用作NAD(P)H再生酶，人们投入了大量努力来提高其稳定性。BmGDH_M6是一种经过改造的Bacillus megaterium GDH变体，具有更强的化学稳定性和耐有机溶剂能力，被开发为高效的辅因子再生酶。同时，通过液-液相分离实现酶的浓缩已成为组织酶催化反应的潜在方法，能够促进缩合物形成的短肽也受到了越来越多的关注。然而，使用传统的基于细胞的表达系统对这些肽标签进行高效筛选和评估仍然具有挑战性。本研究建立了一种基于PURE系统的肽标签筛选策略（PURE系统是一种重组的无细胞蛋白质合成平台），并以BmGDH_M6作为模型酶进行了验证。从含有METAfos信号标签（用于诱导代谢酶形成微滴结构）和IDR（内在无序区域）标签的肽库中，筛选出一种长度为10个氨基酸的K7G3肽标签，该标签能够在特定拥挤条件下使BmGDH_M6形成微滴结构。这些结果表明，PURE系统为体外筛选调控酶组装行为的肽标签提供了快速且可控的平台。

菌株和培养基

大肠杆菌 DH5α (F^?Φ80d lacZΔM15 Δ[lacZYA-argF]U169 deoR recA1 endA1 hsdR17[rK^?mK⁺] phoA supE44 λ^? thi-1 gyrA96 relA1) 用于质粒构建和扩增。大肠杆菌 BL21(DE3) (F^? ompT hsdSB[rB^?mB^?] gal dcm λ (DE3)（Champion 21；Cosmo Bio Co., Ltd., 日本东京）用于重组蛋白表达。大肠杆菌培养使用LB培养基（Nacalai Tesque Inc., 京都，日本），固体培养基中添加了2.0%（w/v）的琼脂。

使用PURE系统合成的蛋白质的SDS-PAGE和Western blot分析

使用PURE系统合成的蛋白质通过SDS-PAGE分离后，用Coomassie Brilliant Blue (CBB)（CBB Stain One Super, Nacalai Tesque）进行染色，并通过半干式转印装置（HorizeBLOT, ATTO）将其转移到硝酸纤维素膜上（Bio-Rad, 东京）。

scENO2融合蛋白无细胞合成中N端标签的优化

BmGDH的四级结构是通过其C末端区域（44,45）之间的相互作用形成的。最新研究表明，将IDR序列融合到BmGDH的C末端会显著降低酶活性（46）。基于这些发现，纯化标签被放置在N端，并在重组蛋白中纯化标签的下游直接连接METAfos或IDR标签。

讨论

本研究开发了一种快速且可扩展的肽标签序列筛选策略，利用PURE系统进行无细胞蛋白质合成。该流程结合了PURE系统中的快速预筛选和随后的大肠杆菌表达实验，以便进行详细分析，从而高效地筛选出具有所需功能的构建体，同时减少了大规模细胞表达和纯化所带来的实验负担。

CRediT作者贡献声明

伊藤原智子（Sayoko Ito-Harashima）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、方法学设计、实验研究。 千田小春（Koharu Alicia Senda）：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、结果验证、方法学设计、实验研究。 川川亚子（Ako Kagawa）：资源提供。 小林诚二（Seiji Kobayashi）：资源提供。 村重由纪（Yuki Muroshige）：资源提供。 松浦智明（Tomoaki Matsuura）：撰写 – 审稿与编辑、资源提供、项目管理、方法学设计、资金申请、概念构思。 三浦奈津子（Natsuko Miura）：撰写 – 审稿与编辑。

手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在撰写过程中，作者使用了ChatGPT 5.2和FLaT工具来纠正语法错误。使用这些工具/服务后，作者对内容进行了必要的审核和编辑，并对发表文章的内容承担全部责任。

致谢

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）KAKENHI项目（JP21H05228/JP21A205/JP21H05225：“Bottom-up Biotech”）的支持。此外，本研究还得到了日本科学技术机构（JST）GteX JPMJGX23B4、JST ACT-X JPMJAX201G、JSPS KAKENHI（JP21H02121/JP23K21174）以及文部科学省（Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology）Q-LEAP JPMXS0120330644项目的资助，同时还得到了大阪府立大学女性研究人员支持办公室的援助。