针对嗜盐菌Salinivibrio的功能基因组学和代谢工程的定制基础编辑工具包

《Journal of Biotechnology》：Tailored Base Editing Toolkits for Functional Genomics and Metabolic Engineering in the Halophile Salinivibrio

高效CRISPR/nCas9碱基编辑系统在盐生菌Salinivibrio sp. TGB4中的应用及代谢机制解析

　　

王梦茹|易九九|李正军

北京化工大学绿色生物制造国家重点实验室、国家生物炼制研发中心及绿色化学品生物制造北京重点实验室，中国北京 100029

摘要

由于缺乏高效的遗传工具，非模式盐生菌的合成生物学发展受到阻碍，这限制了它们的工业应用。在这项研究中，我们报道了一种针对具有工业前景的盐生菌Salinivibrio sp. TGB4的高效碱基编辑平台的开发。我们设计并验证了腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器（ABE和CBE），能够在特定位点进行单碱基、双碱基和三碱基替换。ABE表现出高效率和广泛的PAM（嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤）序列识别能力，而CBE则能够实现精确的C到T的替换。此外，一种新型融合蛋白（PmCDA-TadA8e-nCas9-UGI）促进了协同的双碱基编辑，使得A→G和C→T的同时编辑成为可能，从而扩展了盐生菌基因组工程的潜力。除了工具开发之外，我们还利用该系统阐明了Salinivibrio sp. TGB4中的乙酸代谢途径，鉴定出acs1基因在所测试条件下是乙酸同化和聚(3-羟基丁酸)生物合成的主要基因。这项工作为盐生菌建立了一套多功能的碱基编辑工具包，并展示了其在代谢途径分析中的实用性，从而增强了Salinivibrio sp. TGB4将低成本碳源转化为有价值化学品的遗传工程潜力。

引言

盐生菌因其能够在开放、非无菌条件下发酵，并具有天然的抗污染能力，而被越来越多地认为是可持续生物制造的理想微生物工厂。然而，这些非模式宿主的遗传可操作性仍然是一个根本性瓶颈，严重限制了途径工程和功能基因组学的潜力（Mitra等人，2020年；Xu等人，2024年）。CRISPR介导的碱基编辑技术能够在不产生双链断裂的情况下实现精确的单核苷酸替换，为无痕基因组工程提供了强大手段（Anzalone等人，2020年；Hwang等人，2024年）。碱基编辑器，特别是胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器（CBE和ABE），已在哺乳动物细胞（Levy等人，2020年；Yoon等人，2023年）、植物（Li等人，2018年）和模式微生物（Sun等人，2020年；Tong等人，2019年；Yu Been Heo，2022年；Zheng等人，2018年）中得到广泛应用，用于功能基因组学研究（Despres等人，2020年；Gaudelli等人，2017年；Komor等人，2016年）、疾病建模（Davis等人，2022年；Nishida等人，2016年）和代谢工程（Tao等人，2023年）。然而，它们在非模式微生物中的潜力尚未得到充分探索（Lim，2025年；Lu等人，2022年）。初步尝试已经证实了这些挑战，因为传统的编辑器结构在某些物种中无效。特别是，在Vibrio natriegens中，由于Cas9介导的DNA切割导致细胞死亡，这可能是因为该物种缺乏非同源末端连接能力（Stukenberg等人，2022年）。

Salinivibrio属于Vibrionaceae科，是一种从中盐环境分离出的中度盐生细菌，具有很强的耐盐性和代谢灵活性，使其成为生物修复（Hamad和Mohamed，2025年）、生物聚合物生产（Tao等人，2022a；Tao等人，2021年；Tao等人，2022b）以及增值化学品合成（Amoozegar等人，2008年；Guynn等人，2023年）的理想候选菌株。尽管具有潜力，但由于缺乏高效和精确的基因组编辑工具，其发展受到限制（Li等人，2025年；Pu等人，2025年）。在这些宿主中开发基于CRISPR的系统面临诸如启动子不兼容、密码子使用偏好和严格的PAM要求等障碍（Vento等人，2019年）。尽管最近出现的如SpCas9-NG和xCas9（Hu等人，2018年）等放宽PAM要求的Cas9变体扩大了可编辑的基因组位点范围，但多重碱基编辑策略现在能够同时修改多个位点，加速了途径工程和功能基因组学研究（Zhang等人，2024年；Zhao等人，2023a）。

在这项研究中，我们开发了首个针对Salinivibrio菌株的CRISPR/nCas9基碱基编辑系统。该系统实现了高效的腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑，能够在单个编辑窗口内进行单碱基、双碱基和三碱基替换，并具有广泛的PAM识别能力，同时支持A→G和C→T的编辑。除了工具开发之外，我们还利用胞嘧啶碱基编辑器鉴定出acs1基因是乙酸同化和聚(3-羟基丁酸)（PHB）生物合成的关键基因。总体而言，这些结果为Salinivibrio建立了一套多功能且精确的基因组编辑工具包，扩展了盐生菌的遗传工程能力，为合成生物学和工业生物技术的未来应用奠定了基础。

部分内容摘录

菌株和培养条件

本研究使用的所有菌株列于表S1中。野生型Salinivibrio sp. TGB4最初是从中国天津滨海新区的一个盐田中分离出来的，并存放在中国普通微生物保藏中心（保藏编号21105）。其完整基因组序列可在NCBI GenBank数据库中找到，编号为GCA_027286385.1。E. coli DH5α用于质粒构建，E. coli S17-1作为供体菌株

在Salinivibrio sp. TGB4中建立和验证ABE和CBE系统

最初尝试使用基于dCas9的架构在Salinivibrio sp. TGB4中建立碱基编辑系统时未能产生编辑效果。因此，我们基于nCas9（D10A）开发了腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑系统（图1A）。ABE编辑器是通过将TadA8e融合到nCas9的N末端制备的。TadA8e是一种进化而来的Escherichia coli腺嘌呤脱氨酶，具有高活性和宽编辑窗口（Richter等人，2020年）。对于胞嘧啶编辑，CBE系统

结论

在这项研究中，我们在盐生菌Salinivibrio sp. TGB4中建立了高效的CRISPR/nCas9介导的碱基编辑系统。所得到的ABE和CBE系统均实现了高达100%的精确单碱基替换效率，证明了其在这一非模式生物体中的强大活性。ABE系统表现出优越的多重编辑能力，能够高效地进行双碱基甚至三碱基编辑，而CBE在多重编辑场景中的效果较差。

未引用的参考文献

(Nishimasu等人，2018年；Tao等人，2022年；Tao等人，2022年；Yu Been等人，2022年；Zhao等人，2023年；Zhao等人，2023年)

资助

本研究得到了国家自然科学基金（U22A20426）的资助。

CRediT作者贡献声明

M.-R.W.完成了大部分实验工作和数据分析。J.Y.参与了实验验证和数据可视化。Z.-J.L.提出了研究方案并提供了总体指导。所有作者都参与了手稿的审阅和编辑，并批准了最终版本。

CRediT作者贡献声明

易九九：验证、研究。王梦茹：撰写——初稿、方法学、研究。李正军：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。