一种基于智能手机集成比色适配体的检测方法，该方法利用模拟过氧化酶功能的金纳米酶来检测鱼肌肉中的土霉素

《Methods》：Smartphone-integrated colorimetric aptamer-based assay employing peroxidase-mimetic gold nanozymes for oxytetracycline detection in fish muscle

本研究开发了一种基于智能手机的检测方法，利用金纳米颗粒（AuNPs）的过氧化物酶样活性和特异性结合的aptamer，实现对鱼肌肉中四环素类抗生素氧四环素（OTc）的高灵敏度快速检测，检测限为0.011 mg/L，低于欧盟和FSSAI的标准。

　　

Dhruba Jyoti Sarkar|Ramij Raja|Soumyadeb Bhattacharyya|Souvik Pal|Subhankar Mukherjee|Basanta Kumar Das

摘要

近年来，基于智能手机的传感系统因其即时检测潜力而受到了广泛关注。在这项研究中，开发了一种利用特定于氧四环素（OTc）的适配体和金纳米粒子（AuNPs）的纳米酶活性来辅助检测鱼肌肉中OTc的方法。经过适配体修饰的AuNPs（Apt–AuNPs）通过类似过氧化酶的活性催化TMB的氧化，生成蓝色的氧化TMB物质。然而，OTc以剂量依赖的方式抑制Apt-AuNPs的过氧化酶活性和蓝色物质的形成，从而可以通过基于RGB数据的图像分析来检测OTc。该适配体检测方法对OTc具有高度选择性，仅受非目标抗生素的轻微干扰。该方法的最小检测浓度为0.01–0.50?mg L^?1，其检测限为0.011?mg L^?1，远低于欧盟（EU）和FSSAI指南规定的最大允许残留水平（0.10?mg kg^?1）。基于智能手机的适配体传感技术在快速、灵敏地检测食品鱼样本中的OTc方面显示出巨大潜力。

引言

水产养殖中的一个主要挑战是疾病的频繁发生，这主要通过使用传统抗生素来控制。全球范围内，多种抗生素如四环素、氧四环素、氧氯苯酸、氟喹诺酮、环丙沙星、阿莫西林、链霉素、红霉素等被广泛用于治疗水产养殖中的各种细菌感染[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。然而，抗生素的不负责任使用导致了病原体抗性的产生，并且由于食物中的抗生素残留物引发了严重的安全问题[6]、[7]。由于抗生素的过度使用和代谢不足，鱼肌肉中经常检测到抗生素残留[6]、[7]。因此，印度食品安全标准局（FSSAI）和欧盟（EU）等机构已经制定了鱼肌肉中抗生素的最大允许残留限量[6]、[8]、[9]。例如，对于氧四环素（OTc），欧盟和FSSAI设定的最大残留限为0.10?mg kg^?1[8]、[10]。

四环素类的抗生素OTc被联合国粮农组织（FAO）推荐用于水产养殖[11]，并广泛用于控制鱼类中的细菌感染。已有大量关于鱼肌肉中OTc残留频繁出现的报告[12]、[13]。有多种分析方法可用于测量鱼肌肉中的OTc含量，包括使用UV–Vis[14]、LC（Chappell等人，1986年；MacNeil等人，1996年）、LC-MS/MS[15]、UPLC–MS/MS[16]、[17]、带荧光检测器的LC[18]、微生物检测[19]、免疫检测[20]、毛细管电泳[21]等方法，这些方法都能实现OTc的灵敏和准确检测。然而，这些方法通常需要先进的仪器、复杂的样品制备过程以及高技能的操作人员。因此，迫切需要制造一种智能传感设备，以实现精确的现场检测，从而无需特殊设备即可快速、简便地完成检测，克服上述限制。

通常，比色生物传感方法依赖于传感元件的颜色变化，这些元件通常采用具有较大比表面积的纳米粒子来更好地固定分子识别元件（MREs）[22]、[23]、[2]。在最近十年中，由于适配体具有更好的稳定性和高特异性，在开发针对多种目标分析物的生物传感器方面取得了巨大进展[24]。基于适配体的方法在食品中监测抗生素残留方面的有效性已经得到充分验证，例如使用比色适配体在现场检测牛奶中的OTc[25]，以及使用磁珠-金纳米粒子辅助的比色适配体系统检测OTc和卡那霉素[2]。此外，还有报道利用适配体作为传感元件开发了一次性电流磁传感器来检测牛奶中的OTc[26]、电化学方法检测牛奶中的OTc[27]，以及基于纸张的试纸条检测水环境中的OTc[28]。适配体的使用不仅显示出高的分析效率，还具有低成本、高稳定性、易于修改等优点[29]、[30]、[31]、[3]。尽管有许多关于在多种食品基质（尤其是牛奶）中检测OTc的报告，但关于在鱼肌肉中通过比色法检测OTc的报告却相对较少（见表S1）。

最近，将生物传感器与基于智能手机的检测技术结合使用受到了广泛关注。基于RGB矩阵的智能手机设备已被用于分析应用，例如测定生物乙醇中的铁（III）[32]、废水中的重金属[33]、食品和环境样本中的氟喹诺酮类抗生素[34]。同样，也有一些关于在食品基质中检测OTc的智能手机应用的报道（见表S1）。然而，在这些报告中，检测原理主要基于OTc对各种无机传感器探针（如UiO-碳点[35]、Eu/Ce-MOFs[36]、Fe₃O₄-CDs–CitNa–Eu³⁺[37]）的荧光淬灭或增强效应。在一些报告中，利用UiO-66(Fe/Zr)–NH₂[38]和NH₂-MIL-88B (Fe, Ni)[39]的纳米酶特性作为OTc的传感器探针，并通过智能手机进行图像分析。除了一个例外，其中使用了特定于OTc的适配体负载的碳点作为传感器探针，并基于智能手机对OTc诱导的荧光淬灭进行图像分析[40]，但之前的研究指出，与基于纳米酶的比色传感器相比，荧光传感器存在光敏剂保留时间短、光漂白等问题[41]。迄今为止，尚未有关于使用过氧化酶纳米酶的智能手机集成适配体检测OTc的报道。因此，在本研究中，将高亲和力的特定于OTc的适配体（Apt）与金纳米粒子（AuNPs）的过氧化酶模拟活性结合，开发了一种用于检测鱼肌肉中OTc的比色适配体方法。该传感机制基于AuNPs-Apt复合物与纳米酶活性的形成。当暴露于OTc时，由于适配体与OTc分子结合，AuNPs-Apt复合物的纳米酶活性降低（见图1）。纳米酶活性的降低导致蓝色强度的浓度依赖性减弱，从而实现OTc的定量检测。利用智能手机提取检测到的蓝色强度的RGB数据，开发出算法，进而计算鱼肌肉中未知的OTc浓度。据我们所知，这是首篇描述使用基于RGB矩阵的智能手机进行鱼肌肉中OTc现场检测的比色适配体方法的报告，具有高精度和可靠性。

试剂

本实验中使用的所有化学物质和试剂均为分析级纯度，无需进一步纯化。本研究中使用的特定于OTc的适配体序列为：5′-GGA ATT CGC TAG CAC GTT GAC GCT GGT GCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGTGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3′[30]，由Integrated DNA Technologies合成，并溶解在分子生物学级水中（Sigma-Aldrich）。使用的氧四环素（OTc）盐酸盐浓度为91.80%，四环素盐酸盐浓度为96.60%。

AuNPs的合成与表征

使用TEM观察了酪氨酸修饰的AuNPs的微观结构（图1A），结果显示它们主要是球形颗粒，尺寸小于50纳米。此外，合成的AuNPs的吸收光谱在520纳米处显示出尖锐的峰值，这是表面等离子体共振（SPR）的特征（图S1）。520纳米处的明显SPR峰值表明这些AuNPs具有低多分散性，与先前的研究结果一致[47]、[48]、[42]。AuNPs的流体动力学直径为...

结论

本研究展示了一种基于适配体的即时检测方法，用于检测鱼肌肉中的OTc，该方法结合了两种转导机制：使用微孔板读数器在650纳米处测量吸光度，并通过智能手机辅助的图像分析来量化R值强度。观察到OTc以剂量依赖的方式抑制AuNP–适配体结合物对TMB的过氧化酶样活性（0.01–0.50?mg L^?1），表现为氧化TMB的吸光度降低和R值信号增强。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢ICAR-国家农业科学基金（NASF/PA-10016/2023-24）在“用于检测鱼中抗生素残留的即时纳米生物传感器”项目中的财政支持。