一种多功能、简单且快速的（VSR）方法，可用于生成基因克隆、多种突变体以及用于分子生物学研究的短基因片段

《Methods》：A versatile, simple, and rapid (VSR) method for generating gene clones, diverse mutants, and short gene fragments for molecular biology applications

基因克隆、定向突变和短基因合成是分子生物学核心工具，但传统方法存在效率低、步骤繁琐、成本高等问题。本研究开发了一种VSR三合一方法，通过重叠延伸PCR技术实现无缝克隆、突变和基因组装，无需纯化或限制酶切割，支持80bp至33kb片段插入及单次反应引入最多17处突变，并成功合成两种完整病毒基因组。该方法高效（转化效率60-100%）、灵活（适用于任意质粒位点）、低成本，适用于常规及高通量研究。

　　

Kavitha Modenkattil Sethumadhavan | Gayatri Kandpal | Jyothilakshmi Sajimon | V.R. Akshay Das | Nirmegh Basu | Athulya Prakash Simla | V.Stalin Raj

摘要

基因克隆、定点突变（SDM）和短基因合成是分子生物学中的重要工具，但现有方法在效率、灵活性和成本方面仍存在局限性。本文开发了一种多功能、简单且快速的（VSR）三合一方法，能够在单一平台上完成无缝克隆、突变和短基因组装。该方法基于重叠延伸聚合酶链反应（O_PCR）原理，使用高保真度DNA聚合酶和短重叠引物。目标基因可以直接从基因组DNA或互补DNA（cDNA）模板中扩增并克隆到载体中，无需中间纯化、限制性内切酶消化或连接步骤。VSR方法支持将长度从80 bp到33 kb的DNA片段插入任何质粒位点，并且可以在单次反应中在一个或多个位点引入单个或多个核苷酸替换。利用该方法，我们成功克隆了35个不同长度的基因以及两个完整的病毒基因组，克隆效率在60%到100%之间，并在单次突变反应中引入了多达17个替换位点。此外，我们还展示了如何从重叠寡核苷酸高效合成短基因。VSR方法是一种可靠、快速且经济高效的方法，适用于常规和高通量实验流程。

引言

基因克隆和定点突变（SDM）是分子生物学研究中的两种基本技术，用于操纵和鉴定基因及其编码蛋白的功能。评估基因功能的关键步骤包括将其克隆到合适的质粒载体中，通过SDM进行突变，并通过体外研究来研究其功能[1], [2], [3], [4], [5]。这些技术在遗传学[6], 生物技术[7], [8], 微生物学[9], 细胞生物学[10], [11], [12], 生物化学[13], [14], 基因工程[15], [16], [17]和生态学[18], [19]等众多研究领域中都至关重要。基因克隆和SDM技术不断得到改进，以简化操作流程，因为目前缺乏替代方法[20], [21]。

Boyer和Cohen首次开发的克隆技术是分子生物学的金标准[3]，但它需要多步骤操作，包括选择与载体和插入片段兼容的限制性内切酶，随后进行聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶消化、连接以及菌落筛选，整个过程耗时较长[22], [23]，通常需要几天到几周才能完成。此外，故障排除也较为繁琐。重组DNA技术的最新进展使得开发出了一些改进的克隆方法，如无需连接的克隆（LIC）[24], Gibson组装[25], In-Fusion[26], TOPO[27], [28], 无需序列和连接的克隆（SLIC）[29], [30]以及Gateway克隆[31], [32]。然而，每种方法都有其优缺点。例如，Gibson组装虽然在组装和克隆大DNA片段方面效率高，但不适合克隆短DNA片段（<250 bp），因为反应混合物中的T5外切酶会导致片段降解[33]。同样，Gateway和TOPO克隆需要使用专有的商业载体[34], [35]，这限制了实验设计的灵活性并增加了总体成本。LIC要求插入片段和载体两端都有特定的5′和3′突出端，从而限制了插入片段的设计；而改进的SLIC在突出端形成稳定二级结构时效率较低，因为这会降低T4 DNA聚合酶的结合效率[4]。尽管有多种克隆方法和试剂盒可用，但持续的研究旨在提高这些方法的效率和易用性。最近，合成质粒构建体被用于生物技术应用，以克服克隆过程中的障碍[36], [37]。然而，这种大规模基因合成或克隆在资源有限的实验室环境中受到成本限制[38], [39], [40]。

同样，SDM也是分子生物学中常用的一种方法。通常，为了理解基因、氨基酸或蛋白质结构中结构域的功能，需要将所需的突变引入寡核苷酸中，然后通过标准PCR扩增将其克隆到质粒中[41], [42]。随着定点突变在分子生物学和基因工程中的重要性日益增加，近年来开发出了多种新方法，包括限制性位点辅助SDM、酶促反向PCR、QuikChange突变、重组辅助巨引物（RAM）克隆、巨引物PCR突变、定点连接酶独立突变（SLIM）和P3定点突变[43], [44], [45], [46], [47], [48], [49]。然而，这些方法存在一定的局限性，例如需要长互补引物对，可能导致非特异性突变和缺失[50], [51]。此外，由于需要保留原始质粒和突变体，因此需要测序更多克隆株以获得所需的突变质粒[46], [52]。值得注意的是，在大质粒（>7 kb）中引入突变时，通常会将目标基因亚克隆到小载体中以提高突变效率并减少非特异性突变。这一过程包括多个步骤，如限制性内切酶消化、连接、转化、菌落筛选、DNA分离以及将突变序列重新插入原始质粒，非常耗时且劳动强度大[53]。此外，传统方法限制了在单次反应中引入多个或大规模突变[1], [54]。与基因克隆或SDM等传统方法相比，基因合成涉及无需模板DNA的化学合成[55], [56]，这提高了实验的灵活性，允许对基因序列进行定制操作，从而可能获得比野生型更优的特性[57]。在难以获取临床材料的情况下（例如新兴SARS-CoV-2变体的各种序列或遗传疾病相关序列），基因合成在加速实验研究方面发挥着关键作用[39], [58], [59]。然而，单独合成每个变体并不经济高效，且从混合群体中选择性地扩增次要变体在技术上也具有挑战性。因此，一种可靠的克隆和引入突变的方法将非常有益，能够系统地生成所有变体，便于功能研究并加深对其生物学意义的理解。最早的基于PCR的无缝DNA组装方法之一是由Pease及其同事开发的重叠延伸PCR[60], [61]。该方法通过在PCR扩增过程中连接含有互补重叠序列的DNA片段来实现基因拼接和定点突变。自开发以来，这一策略已被广泛应用于分子生物学领域。

基于这一原理，我们开发了一种简化的重叠延伸聚合酶链反应（O_PCR）方法，将其发展为一种灵活的单管或双管技术，用于将短基因或大基因/基因组片段克隆到质粒的任何位点。我们展示了O_PCR工作流程在多种应用中的实用性和多功能性，采用统一的实验方法。该协议允许将单个、双个或多个基因片段插入合适的载体中的任何限制性位点，无论片段大小如何，无论是否需要中间PCR纯化步骤。此外，我们还在单次反应中引入了多种定点突变，包括单个和多个位点的替换突变、插入、缺失以及这些突变的组合。我们还改进了该方法，实现了短基因片段的从头合成。

实验片段

氯化钙方法

化学感受态细胞的制备方法如其他文献所述[62]。简要来说，首先从冷冻甘油储备液中接种E. coli DH5α细菌，或从营养琼脂平板上挑取一个单克隆菌落，将其接种到5 ml营养肉汤（NB；HiMedia, #M002）中。细胞在37°C、200 rpm的摇床中孵育过夜。第二天，将1 ml初代培养物接种到100 ml营养肉汤中，并在37°C下继续孵育直至OD₆₀₀

结果

分子克隆和突变是阐明基因与其编码蛋白功能关系的标准方法。鉴于这些方法在分子生物学中的不可或缺的作用，人们一直在寻求更高效、更用户友好的改进策略。在本研究中，我们开发了一种基于PCR的简单多功能方法，用于克隆、突变和基因合成。该方法基于重叠延伸PCR原理[60], [61]

VSR方法克服了传统克隆方法的挑战

接下来，我们应用VSR协议克隆了35个不同片段的基因（长度从80 bp到6 kb），包括病毒基因和真核基因。这些基因片段成功地通过钝端或黏合端克隆策略插入到目标载体中，涉及单次或多次限制性内切酶消化。任何克隆方法的便捷性和灵活性在很大程度上取决于选择合适质粒载体的灵活性

使用单替换突变验证VSR方法

定点突变是一种强大的工具，可以通过精确引入核苷酸变化来研究基因功能。它也被广泛用于重组蛋白和生物体的工程改造，以增强或修改其功能。为了验证VSR方法在SDM中的效率，我们在SARS-CoV-2刺突蛋白的S1结构域以及人类二肽酶4（hDPP4）和人类血管紧张素转换酶2（hACE2）基因中引入了目标突变

讨论

基因克隆和SDM是生命科学领域中用于基因操作和功能研究的基本技术[67], [68], [69]。然而，传统的克隆和突变方法往往繁琐、耗时，并需要技术专长[4], [70]。因此，开发快速、用户友好的策略以简化实验流程和提高效率仍然是分子生物学的研究重点。虽然最近引入了许多改进方法

CRediT作者贡献声明

Kavitha Modenkattil Sethumadhavan：研究、方法学、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。Gayatri Kandpal：研究、方法学、可视化、撰写、审稿与编辑。Jyothilakshmi Sajimon：研究、可视化。V.R. Akshay Das：研究、方法学、可视化、撰写、审稿与编辑。Nirmegh Basu：研究、可视化。Athulya Prakash Simla：研究。V.Stalin Raj：概念构思、研究

资助

本研究得到了印度医学研究委员会（ICMR，新德里，印度）（项目编号：IIRPIG-2023-0001280）、Anusandhan国家研究基金会（ERSTWHILE SERB）核心研究基金（新德里，印度，项目编号：CRG/2023/008001）以及印度科学教育与研究所Thiruvananthapuram（IISER TVM）的内部支持。K.M.S.获得了总理研究奖学金（PMRF）。G.K.获得了IISER-TVM的博士奖学金。V.R.A.D.

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们的实验室中的多位研究人员测试了这些方法。我们感谢Virology Scientific Research实验室的Karthika T、Malavika Prakash、Harshal Srivastava、Saran M、Shreosi Basu和Azeem Abdul Kalam，以及IISER-TVM生物学院的HapGen实验室的Tejas T. M.在使用我们的方法生成基因克隆和进行定点突变方面所做出的贡献。