转录组学揭示Dsx1是甲壳动物性别二态性的关键调控因子

《Integrative Zoology》：Transcriptomics Unveil Dsx1 as a Critical Regulator in Sexual Dimorphism of Crustaceans

　　

：性别二态性特征涉及生殖竞争，并在发育过程中通过性别偏向性基因表达程序形成。本研究利用RNA测序（RNA-seq）数据，分析了端足类甲壳动物雄性（male）和雌性（female）T3（第三胸肢）肢在整个发育过程中的差异。通过比较转录组（comparative transcriptome）分析，研究人员发现Dsx1基因在 Morinoia aosen发育过程中呈现雄性偏向性表达，并探究了其系统发育（phylogeny）。随后，在截肢的雄性个体中进行RNA干扰（RNA interference），发现敲低（knockdown）Dsx1会导致再生的T3肢趾节（dactylus）雌性化。最后，为了理解性别差异胚胎发育的遗传调控，研究人员在甲壳动物模式物种 Parhyale hawaiensis中进行了CRISPR-Cas9基因敲除（knockout），验证了雄性突变体中T3肢的雌性化。综合来看，系统发育分析和基因敲除实验确定了同源基因，并揭示了 Dsx1在不同物种间的保守功能。该研究为性别偏向性基因表达与性别二态性特征之间的因果关系提供了见解。

论文解读：

一、研究背景与问题

许多生物演化出显著的性别二态性（sexual dimorphism）特征以适应生殖竞争，如昆虫的角、鸟类的羽色。这些特征通常由性别偏向性（sex-biased）基因表达程序调控，其中Doublesex and male abnormal-3 related transcription factor (Dmrt) 基因家族被认为是高度保守的关键调控因子。然而，现有研究多集中于成虫阶段，对性别二态性特征的发育动态（developmental dynamics）和分子机制了解甚少。端足类（amphipods）甲壳动物是研究此问题的理想模型：其成年雄性具有用于交配时抓握雌性的、显著增大的第三胸肢（T3 leg），表现出明显的性别二态性；其胚胎发育直接，幼体与成虫形态相似，且具备强大的肢体再生能力；部分物种已建立基因编辑（gene editing）方法。因此，明确控制T3肢性别分化的核心基因及其在发育和再生过程中的作用，对于理解性别二态性演化、发育机制乃至甲壳动物的单性养殖（monosex aquaculture）均具有重要理论与应用价值。本研究围绕三个核心问题展开：1. Dsx基因在端足类T3肢发育中是否呈现雄性偏向性表达？2. 在截肢的雄性成虫中敲低Dsx基因能否诱导再生T3肢雌性化？3. 在胚胎发育阶段敲除Dsx基因是否会导致雄性T3肢雌性化，从而证实其间的因果关系？本论文发表于《Integrative Zoology》。

二、主要关键技术方法

研究人员综合运用了多种技术。首先，以来自北京奥林匹克森林公园的野生型 Morinoia aosen和来自牛津大学的 Parhyale hawaiensisChicago F 品系为研究对象。核心方法包括：1. 对 Morinoia aosen五个发育阶段（幼虫S0、雄性亚成体早期MS1、晚期MS2、雄性成虫MS3、雌性成虫FS3）的T3肢进行RNA测序（RNA-seq）和生物信息学分析，包括差异表达基因（DEGs）鉴定、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和基因本体（GO）/KEGG富集分析。2. 基因功能验证：在 Morinoia aosen雄性成虫截肢后，注射双链RNA（dsRNA）进行RNA干扰（RNAi），观察再生表型；在 Parhyale hawaiensis单细胞胚胎中注射Cas9蛋白和向导RNA（sgRNA）进行CRISPR-Cas9介导的基因敲除，培育突变体并分析其T3肢形态。3. 系统发育分析：利用隐马尔可夫模型（HMMER）搜索DM结构域蛋白，构建最大似然（ML）系统发育树。4. 形态学与分子验证：通过几何形态测量学（geometric morphometrics）分析腕节（carpus）形状，并利用实时定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达。

三、研究结果

3.1 交配行为与性别二态性

观察发现，Morinoia aosen雄性利用其增大的T3肢钩住雌性身体完成交配。幼虫期（S0）两性T3肢形态相似，随发育进展，雌性形态变化不大，而雄性的前节（propodus）逐渐膨大、趾节（dactylus）变长，呈现显著二态性。

3.2 MaDsx1是调控T3肢性别分化的关键基因

转录组分析发现，与幼虫期（S0）相比，雄性发育各阶段（MS1, MS2, MS3）及成年雄性与雌性（MS3 vs. FS3）之间存在大量差异表达基因（DEGs）。WGCNA分析鉴定出与MS1、MS2、MS3阶段分别高度相关的基因模块。其中，与MS3（成虫）阶段最相关的“象牙色模块”（ivory module）基因富集于发育模式、组织重塑等通路。对该模块的枢纽基因（hub genes）与各阶段DEGs取交集，结合共表达网络分析，确定 MaDsx1和 Sox10为关键候选基因。MaDsx1的表达量从S0到MS3持续升高，且在雄性T3肢中的表达显著高于雌性及其他附肢。序列分析还发现 MaDsx1可能结合在 Sox10启动子区，提示其调控作用。结论：MaDsx1是参与T3肢性别分化的关键基因。

3.3 敲低MaDsx1诱导雄性再生趾节向雌性表型发展

在截除趾节的雄性成虫中注射 MaDsx1dsRNA进行RNA干扰。结果显示，与注射 gfpdsRNA的对照组相比，敲低组再生的趾节显著变短，且出现趾甲（nail）的概率更高（85% vs. 32%），表现出类似雌性的表型。qRT-PCR证实敲低组中 MaDsx1和 Sox10表达均显著下降。结论：MaDsx1调控再生T3肢趾节的性别分化。

3.4 DM结构域基因的比对与系统发育

在 Morinoia aosen和 Parhyale hawaiensis中分别鉴定出11个和8个Dmrt基因家族成员，其DM结构域高度保守。MaDsx1和 PhDsx1的DM结构域相似性高。系统发育分析显示，Dsx基因形成三个单系群：六足动物（Hexapoda）支、鳃足动物（Branchiopoda）支和软甲纲（Malacostraca）支。MaDsx1和 PhDsx1同属软甲纲支。结论：MaDsx1和 PhDsx1具有同源性，可能功能相似。

3.5 敲除PhDsx1诱导雄性T3肢腕节向雌性表型发展

在 Parhyale hawaiensis胚胎中进行CRISPR-Cas9敲除，获得 PhDsx1突变体。与野生型雄性相比，杂合（PhDsx1^+/Δ）和纯合（PhDsx1^Δ/Δ）突变体雄性的T3肢腕节出现明显突出，形态更接近雌性，而T3肢其他部分形态与野生型雄性相同。几何形态测量学分析证实突变体与野生型雄性的腕节形态存在显著差异。qRT-PCR显示突变体中 PhDsx1和 Sox10表达量显著降低。结论：Dsx1可引导T3肢部分雌性化，但表型不完全，提示有其他基因参与。

四、讨论与结论总结

研究人员在讨论部分指出，生殖策略的需求驱动了生物性别二态性特征的演化，而Dsx基因是调控此类特征的关键因子。本研究通过整合形态观察、转录组比较和基因编辑，在端足类甲壳动物中系统地探究了Dsx1基因的功能。

首先，发育转录组分析发现Dsx1在雄性T3肢发育过程中呈现持续升高的雄性偏向性表达，且特异性在雄性T3肢中高表达，这与其在其他物种（如 Daphnia magna）雄性发育中上调的模式一致，支持其在触发雄性特异性发育中的作用。

其次，利用端足类的再生能力，研究人员证明在截肢的雄性成虫中敲低 MaDsx1可导致再生的趾节变短并出现趾甲，即产生雌性化表型。这类似于在甲虫中敲低 Dsx导致角发育被抑制的现象，共同证实了 Dsx基因在调控性别特异性表型分化（包括再生过程）中的关键作用。

最后，通过在模式物种 Parhyale hawaiensis胚胎中进行CRISPR-Cas9敲除，研究人员在更接近自然发育的过程中验证了 Dsx1的功能。尽管突变体仅表现出T3肢部分结构（腕节）的雌性化，这与其他研究（如蜜蜂单眼的部分雌性化）中单基因敲除导致不完全表型的结果类似，但仍建立了 Dsx1基因与T3肢性别二态性之间的因果关系，表明可能存在其他基因共同参与这一复杂过程。

系统发育分析表明，MaDsx1和 PhDsx1同属软甲纲Dsx支，具有高度相似的DM结构域，提示了其功能的保守性。

研究结论：综上所述，研究表明，发育过程中雄性偏向性的 Dsx基因表达可能参与触发T3肢的雄性特异性发育，并进一步影响交配策略。该研究通过整合形态观察、遗传比较和基因编辑，扩展了我们对形态与基因之间性别特异性程序的理解。本研究阐明的机制对于理解其他非模式动物的性别二态性特征具有广泛意义。操纵 Dsx基因或可用于甲壳动物的单性养殖。