《Journal of Microscopy》：Advancing collagen-related pathology assessment through second-harmonic generation imaging
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本综述系统阐述了二次谐波(SHG)与偏振分辨二次谐波(P-SHG)成像作为一种无标记、高分辨率的光学技术，在胶原病理评估中的核心原理与应用。它深入探讨了该技术如何定量表征胶原纤维的密度、排列、各向异性等微结构特征，并揭示了其在癌症、纤维化、骨关节炎等多种疾病中作为诊断与预后生物标志物的潜力。文章进一步展望了人工智能(AI)与机器学习(ML)驱动下的自动化定量分析，以及深度组织成像等未来发展方向，为胶原病理学评估提供了从技术创新到临床转化的全面视野。
1 引言
胶原蛋白是人体中最丰富的结构蛋白，构成了结缔组织的基本框架并支撑其机械完整性。它不仅扮演结构角色，还积极参与组织形态发生、重塑、伤口愈合和病理进展等动态生物过程。因此，胶原结构的精确可视化和定量表征对于推进相关研究至关重要。传统的组织学染色等方法存在染色变异性、观察者依赖性解释以及主要定性等局限。在此背景下，二次谐波(SHG)显微成像技术已成为胶原表征的重要工具。SHG是一种非线性成像方法，其中两个光子与诸如纤维状胶原蛋白之类的非中心对称结构相互作用，产生波长为激发光一半的光，从而提供无标记对比。这种特性使得SHG能够以亚微米分辨率、固有的光学切片能力以及适合离体和体内应用的穿透深度，对胶原组织进行定量可视化，克服了组织学、光谱学和电子显微镜方法的关键局限。偏振分辨SHG (P-SHG) 则通过提供对胶原纤维排列、各向异性等方向敏感的信息，进一步增强了对胶原超微结构的分辨能力。
2 利用SHG显微成像评估胶原病理
SHG和P-SHG是评估胶原病理的强大无标记工具。在疾病进展过程中，胶原会发生显著重组，因此对其结构的定量评估至关重要。成像参数如反映纤维粗细和堆积的前向/后向(F/B)强度比、反映胶原密度的SHG强度都是关键指标。P-SHG则通过各向异性参数(r)、斯托克斯矢量分析得出的线偏振度(DOLP)和非线性敏感张量元素比(如χ33/χ31)等，从偏振维度提供了分子取向和手性等深入见解。胶原已成为研究癌症、纤维化、伤口愈合等多种疾病状态的重要生物标志物。
2.1 癌症
在乳腺癌研究中，P-SHG成像显示癌变基质与正常组织的胶原超微结构存在显著差异。恶性肿瘤的R值更高，表明胶原发生了重排；纤维取向分散度降低(纤维更直)，而DLP值降低，表明纤维紊乱和去偏振程度增加。在侵袭性乳腺癌中，SHG显示所有亚型的肿瘤周围胶原指标均一性增加。新辅助化疗会导致乳腺癌发生亚型特异性的胶原重塑。例如，在三阴性乳腺癌中，肿瘤核心的F/B比在化疗后显著增加，且纤维取向分散度降低(表明纤维排列更有序)。在卵巢癌中，SHG显微成像显示，与正常组织和癌前病变相比，高级别浆液性卵巢癌的胶原纤维排列和笔直度显著更高。P-SHG进一步揭示了正常基质、良性肿瘤和高级别恶性肿瘤之间的胶原超微结构差异。
2.2 纤维化
在非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎的研究中，SHG显微成像比传统组织学更早、更精确地检测到胶原变化。SHG强度和高强度像素面积随疾病进展而增加，代表纤维形状和堆积的F/B比在纤维化进展过程中显著增加，从而区分早期和晚期疾病。在小鼠NASH模型研究中，SHG揭示了纤维化进展和逆转过程中动态的、区域特异性的胶原重塑。高脂高糖饮食使胶原比例面积增加137%，而饮食逆转使其减少22%。SHG还早期检测到肝窦周围纤维和晚期间隔纤维化。P-SHG分析表明，各向异性参数的离散度随胶原结构而变化，在纤维化肝脏中该离散度降低，表明纤维排列更有序、刚度增加。
2.3 骨与软骨
在骨关节炎研究中，SHG显微成像结合光学散射和蒙特卡洛模型，揭示了酶处理软骨中区域特异性的胶原降解模式。胰蛋白酶仅引起表层轻微改变，而胶原酶则显著改变深部区域的胶原，降低了散射各向异性(g)。SHG衍生的纹理和纤维指标实现了跨处理组89%–97%的分类准确率。F/B比和异质性揭示了酶特异性的纤维破坏。另一项研究利用P-SHG检测胶原的分子和结构变化，以区分健康、骨关节炎(OA)和类风湿关节炎(RA)软骨。OA表现出更高的张量比(χ33/χ31)和DOLP，表明向I型胶原的转变和纤维组织改善。RA表现出中间程度的改变和更紊乱的取向。
3 SHG显微成像的定量图像分析
定量分析将SHG图像中复杂的视觉模式转化为病理学家可依赖的客观数值参数。核心描述符包括基于强度的统计、胶原含量(面积分数或密度)、纤维取向、各向异性或排列程度，以及反映异质性的纹理度量。这些参数共同创建了细胞外基质状态的定量“指纹”，通常与疾病阶段或临床结局强相关。
对于纤维取向分析，常用方法包括傅里叶域分析和结构张量(基于梯度)分析。P-SHG通过系统旋转激发偏振并模拟强度调制，提供了额外的细节维度，能够以更高特异性区分重叠的胶原束并确定其取向。各向异性通过相干性或傅里叶角谱的偏心率/幅度来量化排列程度。在分子束水平，P-SHG提供如ρ比等各向异性度量。纹理特征(如来自灰度共生矩阵GLCM的对比度、同质性、相关性和熵)进一步描述了组织中的微结构模式。
3.1 与组织病理学及其他模态的相关定量分析
整合到数字病理平台中的SHG已成为评估纤维化的有力方法。SHG和P-SHG产生的无标记、定量胶原指标与既定的临床金标准(如H&E染色、天狼星红偏振光染色、METAVIR和Ishak纤维化分期系统)以及其他模态(如双光子激发荧光、宽场偏振显微镜和生物力学测量)具有良好的一致性。在肝纤维化中，多模态SHG/TPEF“qFibrosis”流程量化了未染色活检中的胶原负荷和结构，与METAVIR和Ishak评分高度一致。
3.2 概览：从概念验证到临床验证
人工智能与SHG成像的结合已从早期的概念验证研究发展到应用于临床来源的样本，展示了其转化应用前景。早期方法主要依赖手工特征提取结合传统分类器。深度学习模型(如CNN)通过从原始SHG数据中自动提取特征，超越了这些方法，提高了准确性和泛化能力。该领域已从理论和临床前演示，发展到临床相关组织分析，表明AI增强的SHG正在成熟为一种可重复、高通量且临床可转化的方法。
3.3 AI架构与特征策略
AI辅助的SHG/P-SHG图像分析主要有三种策略：1) 结合机器学习的物理解释性特征提取(如spGLCM结合随机森林)，具有高可解释性但对高阶复杂模式捕捉有限；2) 端到端深度学习架构(如ResNet)，无需显式特征工程；3) 混合框架，将物理解释性特征与深度学习分类器或回归器结合，在可解释性和预测性能间取得平衡。
3.4 P-SHG特异性AI分析趋势
P-SHG数据固有地编码了胶原纤维的方向和分子有序信息。显式利用这一点的AI模型(例如使用偏振分辨纹理描述符，或在多角度SHG图像栈上训练)往往优于在单取向SHG图像上训练的模型。角度分辨深度学习框架将多个角度捕获的偏振信息作为额外输入通道，使CNN能够直接学习偏振依赖的对比模式。
3.5 胶原分割策略
通过分割SHG成像获得的胶原结构来评估生物样本的准确病理状况，深度学习算法已证明其效用。卷积神经网络(CNN) consistently outperforms conventional methods by providing accuracies above 90% even at greater imaging depths, thereby demonstrating the robustness of the delineation of collagen fibres across heterogeneous tissue environments.利用预训练2D模型的权重，先进的神经架构(如Inception-ResNet-3D)能够实现局部纤维取向的3D分割，为解析体积SHG数据集中不确定的胶原排列提供了可扩展的框架。
分割也应用于涉及组织胶原内容的上皮分割，以通过标签免费多光子显微镜结合深度学习实现前列腺癌的自动化Gleason分级。此外，基于SHG成像的分割已被用于检测软骨的结构损伤，其中YOLOv8被用于识别关节软骨胶原网络中的微裂纹。
4 SHG成像评估胶原病理的挑战与限制
SHG和P-SHG成像在胶原病理评估中的应用面临许多实际挑战。该技术依赖精密、高成本的仪器，这限制了其在资源有限环境中的可及性。成像深度受组织散射和吸收效应限制。SHG的分子特异性较窄，主要对胶原等非中心对称结构敏感。许多分析流程仍依赖逐像素计算和手动操作，既耗时又可能引入用户依赖性偏差。新兴的深度学习流程通过自动化特征提取和量化提供了有前景的解决方案，但广泛采用需要大型标准化数据集和跨成像系统的稳健验证。
数据稀缺性和泛化能力是AI临床应用的关键问题。许多研究使用小型、单中心队列，在不同患者群体和成像硬件间的性能尚未统一。可解释性对于临床采用AI-based SHG/P-SHG分类至关重要。临床医生、监管者和最终用户需要了解AI模型如何做出决策。现有研究表明，许多可解释AI方法未能满足临床对可靠性或真实性的要求。最后，满足监管和认证标准仍然非易事。
5 SHG成像评估胶原病理的未来展望
胶原病理评估的未来前景由多模态非线性光学技术、计算策略以及AI/ML整合的进步所塑造。为实现毫米级深度穿透，SHG与深度组织成像(涉及先进的组织透明化和优化的制备方法)相结合是一个有前景的研究方向。这将实现胶原结构全面的三维可视化。SHG固有的无标记优势使其能够定量评估胶原排列和取向，而不受组织学染色变异性的影响。将光学特征与生物力学和病理状况联系起来的新兴方法，有望产生更准确的诊断和预后生物标志物。AI/ML的整合预计将自动化胶原量化，实现数字病理流程内的客观病理评估。
并行努力还包括使SHG成像小型化和降低成本，以推动其向医疗级设备转化。多模态成像系统可提供全面的结构和功能组织表征。特别是基于SHG的光纤探头已显示出在体乳腺肿瘤检测、淋巴结受累评估和实时活检引导方面的潜力。几家初创公司正在积极开发紧凑、稳健的非线性成像设备。超越技术层面，SHG成像预计将影响更广泛的临床研究领域，包括肿瘤学、纤维化、心血管病理学等，从深度组织访问和高分辨率胶原绘图中受益。总而言之，SHG/P-SHG正处于一个关键节点：作为一种有前景的下一代无标记成像模态，但在充分发挥其临床转化潜力之前，需要在标准化、验证和工作流程整合方面进行系统性的努力。
