开发来自Vibrio fluvialis的稳定转氨酶：用于非水相生物催化的固定化技术

《Process Biochemistry》：Towards a robust transaminase from Vibrio fluvialis: Immobilization for non-aqueous biocatalysis

ω-转氨酶Vfat在三种固定化支持上的稳定性与催化性能研究，糖醛酸激活琼脂糖通过多点共价固定化实现最高活性回收率（IYa>94%，GYa>36%），并表现出优异的DMSO耐受性。

　　

Karen Rodríguez-Nú?ez|Camila Oliveri|Carlos Vera|Ronny Martínez|Claudia Bernal

拉塞雷纳大学工程学院食品工程系生物工艺酶技术实验室，Raúl Bitrán，拉塞雷纳1305，智利

摘要

ω-转氨酶是不对称合成手性胺类化合物的关键生物催化剂；然而，由于在高浓度有机溶剂存在下稳定性不足，其工业应用受到限制。在本研究中，来自Vibrio fluvialis（Vfat）的重组转氨酶直接从原始细胞裂解物中固定在三种载体上：羟基官能化的二氧化硅、氨基丙基官能化的二氧化硅以及羟基活化的琼脂糖。这些系统在含有高比例有机溶剂（50–60% v/v）的培养基中进行了系统评估。通过DRIFT-FTIR和SDS–PAGE确认了载体的官能化及酶的沉积情况，而固定动力学和基于活性的参数显示出了强烈的载体依赖性效应。羟基活化的琼脂糖实现了多点共价固定，获得了最高的整体活性恢复率（IYa > 94%；GYa > 36%）。这种固定方式增强了结构刚性，并限制了溶剂引起的变性。因此，选择了这种载体进行稳定性研究。固定在羟基活化的琼脂糖上的Vfat在DMSO（50–60% v/v）中48小时后仍保留了约55%的残余活性，而可溶性酶则完全失活（RA ≈ 0%）。对DMSO的高耐受性突显了共价固定技术在保持酶结构方面的有效性。总体而言，载体化学性质和固定策略对Vfat的性能至关重要，其中羟基活化的琼脂糖被证明是一个适用于溶剂密集型生物催化的稳健平台。

引言

ω-转氨酶是一类具有重大工业价值的生物催化剂，因为它们能够通过外消旋胺的动态拆分或前手性酮的直接不对称氨基化来合成手性胺[1]。这些酶利用吡哆醛5′-磷酸（PLP）作为辅因子，该辅因子无需外部再生，从而实现高度对映选择性的单步转化[1]。然而，由于在工艺相关条件下的稳定性不足[3]，[4]，[5]，它们的广泛应用仍然受到限制。实际上，ω-转氨酶经常在有机共溶剂存在下或在部分非水环境中操作，特别是在制药和精细化工领域[6]。在这些环境中，稳定性指的是酶在其非天然水环境（包括暴露于有机溶剂和固定所需的化学条件）下仍能保持催化活性的能力。

使用有机共溶剂通常是必要的，以便溶解疏水性或空间要求较高的底物，并达到经济可行工艺所需的高底物浓度[7]，[8]。此外，由于转氨反应的可逆性，有机溶剂和水-有机双相系统被用来使反应平衡向产物形成方向偏移，减轻产物抑制，并改善传质[7]，[8]。在某些情况下，使用有机介质还提高了反应速率，并增加了对替代胺供体的耐受性，从而提高了整体工艺生产力[9]。

然而，这样的条件往往会导致催化活性的显著损失，因为ω-转氨酶的结构和动力学已经适应了主要在水介质中的操作[10]。有机溶剂可能引起构象变化，改变反应动力学，并促进酶的失活或变性[11]。尽管在许多合成过程中不可或缺[11]，但有机溶剂对ω-转氨酶在工业生物催化中的应用构成了主要挑战[7]，特别是对于转化大分子结构的高价值化合物[2]。因此，目前只有少数ω-转氨酶适用于工业规模的应用[12]。

为克服这些限制，人们广泛采用了酶固定技术来提高酶的稳定性，实现重复使用，并便于其在连续或半连续工艺中的应用[13]。在这方面，共价固定和静电固定代表了两种根本不同的方法，它们之间的区别在于酶-载体相互作用的性质及其功能后果。共价固定依赖于形成强而不可逆的化学键，防止酶的渗出，提供更好的操作稳定性和可重复使用性，同时可能允许控制酶的方向[14]。然而，建立多个刚性连接点可能会带来构象限制，从而影响催化性能[15]。相比之下，静电固定依赖于较弱的相互作用（如离子键、范德华力和氢键），通常在温和的水性条件下进行，从而有利于结构保持，并使活性位点保持天然状态[16]。尽管如此，其可逆性可能导致酶的解吸和操作稳定性的降低[15]，[16]。由于ω-转氨酶对固体载体施加的构象限制以及共价连接所需的化学条件特别敏感[15]，[17]，因此它们的固定尤其具有挑战性。对于以严格对映选择性和广泛胺供体接受性而闻名的Vibrio fluvialis（Vfat）转氨酶来说，这一点尤为突出[18]，[19]。尽管具有有利的催化性质，Vfat对物理化学扰动非常敏感，使其固定和稳定变得特别困难。

原则上，酶固定有望通过限制构象流动性、保护酶的微环境并在不适合可溶性酶的条件下实现重复使用来缓解这些限制[20]。然而，关于Vfat固定的研究仍然很少且零散。报道的策略包括包封、基于壳聚糖的基质以及商业聚合物载体（如Sepabeads?），但这些方法通常只带来了有限的改进[21]。例如，共价固定在羟基活化的琼脂糖上使得酶能够在连续流系统中使用[22]，但仅报告了大约30%的活性恢复率，这突显了活性位点对固定引起的结构限制的敏感性[22]。

在这个框架下，很少有研究探索改进Vfat性能的策略，包括调节酶的微环境、与吡哆醛5′-磷酸（PLP）的共固定，以及在不同载体上的共价固定方案的应用[23]，[24]。虽然这些努力提高了对Vfat在非传统条件下的理解，但也表明酶固定仍是一个需要进一步发展的领域。考虑到需要将Vfat适应于高有机溶剂浓度和更苛刻的操作条件，研究载体化学性质、固定方式以及固定后产生的微环境如何共同影响酶的稳定性和催化性能是相关的。与其他ω-转氨酶和依赖PLP的酶不同，对于Vfat来说，固定已被证明是扩展其操作窗口的有效策略，但在有机溶剂存在下的行为研究较少。更全面地理解这些因素对于开发稳健的、具有工业相关性的固定化生物催化剂至关重要。

部分摘录

化学品

使用了以下分析级试剂：HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸，C₈H₁₈N₂O₄S）、硅酸钠（SiO₂*Na₂O）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（C₁₉H₄₂BrN）、乙酸乙酯（EtAc）、异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、磷酸钾（K₂HPO₄）、硫酸卡那霉素、碳酸氢钠（NaHCO₃）、3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）、丙酮（C₃H₆O）、硫酸（H₂SO₄）、过碘酸钠（NaIO₄）、蛋白胨

结果与讨论

本研究采用系统化的固定方法，优化了Vibrio fluvialis（Vfat）转氨酶在工业生物催化相关条件下的性能（图1）。评估了不同的固定载体和化学方法，以提高其在有机溶剂存在下的活性保留率和稳定性。本节的结果描述了合适的固定条件的选择以及Vfat制备物的鉴定

结论

本研究对三种Vfat固定平台进行了比较和系统的评估，强调了载体化学性质、固定机制和酶内在性质之间的相互作用如何决定最终生物催化剂的性能。虽然羟基官能化的二氧化硅在评估条件下未能产生具有催化活性的制备物，但结果强调了载体结构和固定环境的重要性

CRediT作者贡献声明

Claudia Bernal：撰写 – 审稿与编辑、资源提供、方法论、研究设计、概念化。Carlos Vera：撰写 – 审稿与编辑、资源提供、方法论。Ronny Martínez：撰写 – 审稿与编辑、资源提供、方法论、研究设计。Rodríguez-Nú?ez Karen E.：撰写 – 原稿撰写、资源提供、项目管理、方法论、研究设计、资金获取、数据分析、概念化。Camila Oliveri：撰写 – 原稿撰写、数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

Karen Rodríguez-Nú?ez衷心感谢ANID FONDECYT POSTDOCTORAL（编号：3230020）的支持。