《Steroids》：ELISA-based validation of differentially expressed Fibrinogen, S100A9, SERPINA3 and SERPINA6 proteins in Polycystic Ovary Syndrome (PCOS)
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本研究通过ELISA技术验证了四项血清蛋白在PCOS患者与健康对照组中的差异表达，并利用ROC曲线分析其诊断效能。结果显示，Fibrinogen和SERPINA3的AUC值较高（0.707和0.725），提示它们可能作为PCOS的诊断标志物。
Sabeen Fatima | Junaid Ahmed Kori | Soma Vankwani | Munazza Raza Mirza | Rehana Rehman
巴基斯坦卡拉奇阿迦汗大学生物与生物医学科学系
摘要
背景与目的
多囊卵巢综合征（PCOS）的诊断仍然具有挑战性，尤其是在临床决策高度依赖卵巢形态学的情况下，而卵巢形态学常常被误解读。为了寻找更客观的分子指标，我们验证了在早期基于nLC-MS/MS的蛋白质组学研究中发现的四种血清蛋白：纤维蛋白原、S100A9、SERPINA3和SERPINA6。研究目的是分析这些蛋白的差异表达，并通过ROC曲线评估其诊断性能。
方法
血液样本来自阿迦汗大学医院的内分泌科诊所，并分为两组：44例不孕的PCOS患者和44例健康的对照组女性。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术验证这些蛋白。统计分析采用SPSS（IBM SPSS 21）软件，ROC曲线的生成则使用GraphPad统计软件（v.8.02）。
结果
PCOS组与健康对照组在年龄和BMI方面无显著差异，但在FSH、LH和AMH水平上存在显著差异。ELISA检测的结果与质谱数据一致。纤维蛋白原和SERPINA6在PCOS女性中的浓度显著升高（p值<0.05），而S100A9和SERPINA3的蛋白表达水平则显著降低（p值<0.05）。ROC曲线分析显示，所有蛋白的AUC（曲线下面积）值介于0.639至0.725之间，表明这些差异表达蛋白具有较好的区分能力，其中纤维蛋白原（AUC=0.707）和SERPINA3（AUC=0.725）的区分效率较高。
结论
综上所述，这些血清蛋白可能作为PCOS的诊断工具。
引言
多囊卵巢综合征（PCOS）的特征是雄激素过多、多囊卵巢、排卵功能障碍和闭经。据估计，全球约有340万育龄女性患有PCOS[1][2]。PCOS的成因包括遗传因素、生活方式或环境因素以及神经内分泌因素[2][3]。作为一种代谢紊乱，PCOS与肥胖[4]、胰岛素抵抗[5]、2型糖尿病、血脂异常[6]、高血压[6][8][9]、子宫内膜癌[10]以及焦虑、饮食障碍和身体形象困扰等精神疾病[11][12][13]有关。此外，多项研究表明炎症因素与PCOS密切相关，提示这些患者体内的炎症水平较高[14]。PCOS的诊断依据是罗德特丹标准，该标准基于其临床症状和体征[15][16][17][18]。具有以下三种特征中的两种（排卵功能障碍、高雄激素血症和多囊卵巢形态）的女性被视为PCOS患者[19]。然而，由于过度解读或误判，超声检查中的卵泡评估已成为PCOS的常用诊断工具。在许多情况下，黄体或主导卵泡会被忽略，导致女性被错误地诊断为PCOS，除非进行额外的临床或生化评估[20]。这凸显了寻找新的生物标志物的必要性，以便实现更准确的诊断和更有效的治疗[21]。
纤维蛋白原是一种糖蛋白，是纤维蛋白的前体[22]。研究发现PCOS患者的纤维蛋白原水平较高[23]，但其作为诊断标志物的作用仍存在争议[24][25]。血栓形成倾向会导致纤维蛋白原及其纤溶酶水平异常，进而引发妊娠并发症，如PCOS女性自然流产率增加[22]。纤维蛋白溶酶活性受损也会增加PCOS患者的心血管疾病风险[26]。S100A9蛋白在胚胎着床中起作用，可作为评估子宫内膜接受性的潜在标志物。它存在于人类输卵管中，与配子相互作用，并调节输卵管微环境中的生殖活动[27]。与健康对照组相比，不孕PCOS组的S100A9水平较低[28]。目前，其不良妊娠后果和生殖健康影响正在研究中[29]。SERPINA3和SERPINA6是一类异质性蛋白，参与调节凝血、炎症、血栓形成和免疫反应等生理过程[30]。它们与PCOS的关联尚不明确，但它们在炎症中起作用，而炎症是PCOS的显著特征。SERPINA3在急性和慢性炎症期间分泌后能抑制多种蛋白酶（包括组织蛋白酶G），从而限制炎症、细胞外基质重塑、凝血过程甚至细胞凋亡[31]。SERPINA6是一种主要的皮质醇转运蛋白，可将皮质醇输送到炎症部位，参与应激反应[32]。
尽管对PCOS进行了大量研究，但其潜在的分子机制仍不甚明了。此外，关于PCOS的蛋白质组学研究不仅在巴基斯坦，而且在全球范围内都较为有限。蛋白质组学研究已鉴定出多种差异表达蛋白，这些蛋白可能在PCOS的病理生理过程中发挥作用[33][34]，但需要实验验证来确认其生物学意义。在本研究中，我们使用ELISA技术分析了不孕PCOS女性与健康女性的血清中四种蛋白（纤维蛋白原、S100A9、SERPINA3和SERPINA6）的差异表达模式[33]。同时，还通过ROC曲线分析评估了这些蛋白作为PCOS生物标志物的诊断性能。这些发现有助于PCOS的诊断、预后和靶向治疗的发展。
主题选择
本研究在阿迦汗大学伦理审查委员会（ERC AKU 2022–7509-22501）的批准下进行[1]。参与者从医院内分泌科招募，并在获得知情同意后参与研究。记录了包括年龄、体重、身高和简要病史在内的社会人口统计信息。受试者被分为两组：健康对照组和PCOS组。
人口统计与生化分析
健康对照组（HC）和PCOS组在年龄（岁）方面的平均值分别为30.3±5.3岁和28.4±4.6岁，无显著差异（p值=0.07）；BMI（kg/m2）分别为23.2±1.4和23.8±2.13，也无显著差异（p值=0.134）。两组的人口统计信息详见表1。
讨论
本研究通过霰弹枪蛋白质组学分析方法评估了不孕PCOS患者与健康对照组中四种蛋白（纤维蛋白原、S100A9、SERPINA3和SERPINA6）的差异表达模式。差异显著的蛋白通过ELISA技术进一步验证。为确保结果的准确性和重复性，我们还进行了ROC分析。
结论
我们的研究提供了初步的蛋白质组学和ELISA证据，证明不孕PCOS患者与健康对照组相比，四种蛋白存在差异表达。具体而言，纤维蛋白原和SERPINA6水平升高，而S100A9和SERPINA3水平降低。ROC曲线分析表明，纤维蛋白原和SERPINA3的区分能力优于S100A9和SERPINA6，提示它们具有作为生物标志物的潜力。然而，这些发现仍需进一步验证。
合规性声明
本研究涉及的所有涉及人类参与者的程序均获得了阿迦汗大学伦理审查委员会（ERC AKU 2022-7509-22501）的批准。项目经费来自AKU-URC研究基金（代码：231026）。参与者来自同医院的内分泌科，所有参与者均签署了知情同意书。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
作者声明仅使用生成式AI或AI辅助技术来改进手稿的语法、清晰度和可读性。文章中的概念、结果和结论均为作者本人的智慧成果。
CRediT作者贡献声明
-Sabeen Fatima：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据分析
-Junaid Ahmed Kori：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析
-Soma Vankwani：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析
-Munazza Raza Mirza：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、项目监督
-Rehana Rehman：撰写、审稿与编辑、初稿撰写
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢Dr. Arfa Azhar在招募女性参与者方面的帮助，以及Ms. Mussarat Ashraf在ELISA数据分析方面的专业支持。同时，特别感谢Bahadur Ali Kamruddin Jessani捐赠教授基金提供的财务支持。此外，也感谢南丹麦大学生物化学与分子生物学系的Mr. Muhammad Tahir和Mr. Martin Rossel Larsen在质谱分析方面的协助。
