通过过脉冲技术和同位素叠加提升ICP-TOF-MS在单细胞代谢组分析中的灵敏度

《Talanta》：Boosting the sensitivity of ICP-TOF-MS for single-cell metallome profiling via overpulsing and isotope summation

单细胞ICP-TOF-MS分析中采用过脉冲技术和同位素加和显著提升低质量元素检测灵敏度，使磷、铁、锌等元素检测限降低2-5倍，细胞中钙检测率从3%-4%提升至74%，硫化物检测率达98%。研究证实这两种技术协同可扩展ICP-TOF-MS在生物医学领域单细胞多元素分析的应用。

　　

Mina Nikoli? | Ana Lores-Padin | Rinus Dejonghe | Olivier De Wever | Frank Vanhaecke

摘要

通过单细胞电感耦合等离子体质谱（SC-ICP-MS）同时测定单个细胞中的内源性元素时，会受到元素含量低以及飞行时间型ICP-MS（ICP-TOF-MS）在低质量范围内固有灵敏度低的挑战。在这项工作中，我们评估了过脉冲技术和同位素叠加技术作为提高低质量范围灵敏度的补充方法。将监测的质量范围从全部元素质量谱缩小到²³Na–⁷⁵As，灵敏度提高了大约2倍；而缩小到³⁰Si–⁷⁵As时，灵敏度提高了大约5倍。这些改进，结合可能的同位素叠加技术，显著提高了检测限，关键元素的检测限通常提高了2–5倍（例如：³¹P从106 fg/cell提高到31 fg/cell；∑Fe从0.69 fg/cell提高到0.19 fg/cell；∑Zn从2.4 fg/cell提高到1.2 fg/cell）。灵敏度的提高直接增加了可检测到的细胞事件的比例。对于红细胞，³¹P的检测率从0%提高到18%；³²S的检测率从46%提高到98%。对于Jurkat和Raji细胞，过脉冲技术使得Na、Mg、P、S、K、Ca、Mn、Fe和Zn的测定成为可能或得到了增强，其中Ca的检测率从3–4%提高到74%，Mn的检测率从<1%提高到54%。总体而言，这些改进扩展了ICP-TOF-MS在生物学和生物医学研究中进行多元素单细胞分析的能力。

引言

单细胞电感耦合等离子体质谱（SC-ICP-MS）已成为在单细胞水平上测定内源性和外源性元素的重要技术。¹ 与传统的批量ICP-MS分析不同，后者通过样品消化和均质化只能提供每个细胞的平均元素含量，而SC-ICP-MS能够提供更详细的细胞内异质性信息。在SC-ICP-MS中，使用低流量样品引入系统将高度稀释的细胞悬浮液逐个引入ICP。每个细胞在时间分辨模式下产生一个短暂的信号，其强度与总元素含量成正比。这种单事件方法最初是从金属纳米颗粒（NPs）², 3, 4, 5引入的，后来扩展到细胞⁶, 7, 8。然而，与NPs相比，细胞分析要困难得多。⁹ 细胞体积更大且更脆弱，难以将其作为完整实体引入ICP，尤其是动物来源的细胞。此外，细胞中的内源性元素含量通常很低，范围从高阿克到低飞克级别，因此需要使用高灵敏度的ICP-MS系统来进行测定。

出于这一需求，大多数SC-ICP-MS研究采用了基于四极杆的仪器，这些仪器具有出色的性能和高灵敏度。它们的使用使得内源性¹⁰, 11和外源性元素（后者来源于NPs¹²、含金属的药物¹⁰或标记有金属标签的生物分子¹⁴）的定量成为可能。然而，基于四极杆的ICP-MS仪器的能力有限，因为它们一次只能监测一个质荷比下的信号强度。对于连续信号，可以通过扫描或峰跳跃方法获得所有所需信息，但由于单细胞事件产生的信号仅持续约500微秒¹⁰，顺序扫描使得每个细胞可测量的元素数量最多只能为一个或两个（当应用峰展宽方法时¹⁵, 16）。这一限制限制了SC-ICP-MS的应用范围和所获得数据的可靠性，因为同时检测多个元素至关重要。

内源性金属离子参与细胞的关键代谢和信号传导功能，其细胞内浓度会随细胞状态动态变化¹⁷。因此，在单细胞水平上研究多种内源性元素之间的相关性可以深入了解细胞内发生的复杂相互作用，从而更好地理解代谢变化、氧化应激或金属稳态。此外，细胞指纹分析也必然基于多元素的同时检测¹⁸。另外，在将外来物质（如NPs、含铂的化疗药物）引入细胞的应用中，同时监测内源性和外源性元素是必要的，因为这有助于评估这些物质对关键金属稳态的影响，并避免结果的解释错误。正如最近的研究¹⁹, 20所报道的，在将含有NPs的细胞输送到ICP的过程中，细胞可能会破裂，释放出原本包含的完整NPs。这种事件会导致多个事件的发生，尽管它们都来源于同一个细胞，从而导致误解。在数据处理步骤中额外监测细胞中含量足够高的内源性元素或外源性细胞标记物（如基于铱的DNA插合物），可以轻松去除相应的数据干扰，从而保证更可靠的结果。

飞行时间型ICP-MS（ICP-TOF-MS）技术能够在不到50微秒的时间内扫描几乎整个元素质量范围，使其非常适合单细胞应用²⁰。然而，这种优势是以灵敏度为代价的，其灵敏度比最先进的基于四极杆的仪器低一个到两个数量级²¹。尽管在正交提取和传输过程中会有一些离子损失，但主要限制在于TOF分析器只采样连续离子束的一小部分。离子以短脉冲形式提取，因此只有那些在正确时刻位于检测器前的离子才能被分析，其余的都被丢弃。这种固有的低占空比降低了离子通量和单核素的灵敏度，从而导致ICP-TOF-MS的检测能力较低²², 23, 24, 25。此外，在较低质量范围内（²⁵，大多数生物相关的内源性元素（Na、Mg、P、S、K、Ca、Cu、Fe和Zn）所在的位置），灵敏度尤其低，进一步限制了ICP-TOF-MS在单细胞分析中的应用。

几种策略可以缓解这些限制。正如Hendriks等人²⁵所报道的，调整碰撞室和离子光学设置可以选择性地增强低质量离子的传输。然而，在这种专门的低m/z模式下，较重物种的传输被完全切断（m/z超过175），限制了可测量的质量范围。虽然这种调优显著提高了最轻元素（如Na、Mg、P）的灵敏度，但会牺牲中间质量区域（大约Ti–Co）的传输，而该区域包含几种重要的微量元素，如Fe、Cu和Zn。这强调了寻找在不限制第一行过渡金属质量区域元素覆盖范围的情况下提高低质量灵敏度的方法的必要性。另一种策略利用了ICP-TOF-MS的准同时检测能力：由于在SC-ICP-MS中，我们通常关注的是目标元素的元素含量而不是特定核素的信号，因此可以在采集后对同一元素的多重同位素信号进行叠加，以提高灵敏度。Lockwood等人²⁶已经证明，这种方法可以显著提高Gd（提高了3.9倍）和Yb（提高了3.3倍）的灵敏度，特别是在检测上转换NPs（通过上转换过程将多个低能光子转换为高能光子的NPs）的背景下。

Lockwood等人²⁶最近引入的第三种策略是增加离子提取事件的频率。这种方法称为“过脉冲”，目前已在Vitesse ICP-TOF-MS仪器（Nu Instruments，英国）中实现。它利用位于提取区和反射镜之间的Bradbury-Nielsen门（也称为“离子屏蔽器”）来限制每个周期内传输的质量范围。通过限制质量窗口，可以在同一采集期间进行多次提取脉冲，从而采样更多的连续离子束，提高占空比和灵敏度。Lockwood等人证明，这种方法可以显著提高上转换NPs的检测率²⁶。具体来说，通过将质量范围缩小到m/z 130 – 176，¹⁵⁸Gd和¹⁷⁴Yb的灵敏度提高了大约3倍。然而，据作者所知，过脉冲技术在单细胞水平上检测低质量范围元素的潜力尚未得到充分研究。

因此，在这项工作中，我们研究了ICP-TOF-MS在测定单个人体细胞中内源性元素方面的能力，由于ICP-TOF-MS对轻元素的固有灵敏度低，这一应用仍然具有挑战性。特别关注了使用同位素叠加和过脉冲技术作为补充方法来提高低质量范围内的灵敏度，重点关注Na、Mg、P、S、K、Ca、Mn、Fe、Cu和Zn等关键元素。研究使用了各种类型的人体细胞悬浮液作为模型样本（即红细胞、Jurkat和Raji细胞系），以评估ICP-TOF-MS在全面多元素单细胞分析中的潜力。

部分摘录

化学品

仪器设置的开发、校准和日常调整是使用从1 g/L（超纯）Mg、S、P、K、Ca、Zn、Cu、Fe、Mn、Co、Ga、In、Ag、Pt、Ce和U单元素标准品（ChemLab，比利时）制备的溶液进行的，这些标准品在0.35 M HNO₃中稀释。使用Milli-Q Element水纯化系统（Millipore，法国）获得超纯水。从ChemLab（比利时）获得14 M HNO₃的纯度水平，并通过Savilex进一步纯化

灵敏度增强采集模式概述

在单个细胞中同时检测必需的内源性元素需要足够的灵敏度，因为这些元素大多存在于低质量范围内。然而，ICP-TOF-MS仪器对低m/z离子的灵敏度天生较低，而这些元素在细胞内的含量（质量）也很低，这使得在单细胞测量中检测和确定它们特别具有挑战性，正如引言中所述。

为了解决这个问题，ICP-TOF-MS仪器进行了

结论

在这项工作中，我们系统地评估了克服ICP-TOF-MS对轻元素低灵敏度的策略，目标是实现单个人体细胞中内源性元素的稳健测定。通过结合过脉冲技术（通过缩小监测的质量范围来提高灵敏度）和同位素叠加技术（在可能的情况下），我们证明了低质量范围内的灵敏度可以显著提高（高达一个数量级）。

CRediT作者贡献声明

Frank Vanhaecke：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、项目管理、资金获取、概念化。Olivier De Wever：撰写 – 审稿与编辑、可视化、资源获取、资金获取。Rinus Dejonghe：资源、方法学。Ana Lores-Padin：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、方法学、调查、正式分析、概念化。Mina Nikoli?：撰写 – 原始草稿、可视化、验证、方法学，

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Ana Lores Padin报告称获得了弗兰德斯研究基金会的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。