《Toxicology in Vitro》：Comparison of two human cell-based in vitro eye hazard assessment methods: the cytotoxicity test for evaluation of eye irritation (CEI) and the OECD 492B method
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新开发的细胞毒性眼刺激测试方法（CEI）与OECD 492B方法在18种化学品分类中的准确性、灵敏度及经济性进行比较，结果显示OECD方法性能更优但成本较高，CEI方法经济性更佳但存在一定误判率。
丹尼尔·克拉科维安（Daniel Krakowian）|普热米斯瓦夫·热姆拉（Przemys?aw ?em?a）|多米尼卡·冈达罗夫斯卡（Dominika G?darowska）|英格·姆尔兹克（Inga Mrzyk）
卢卡谢维奇研究网络（?ukasiewicz Research Network）——工业有机化学研究所普什奇纳分部（Pszczyna），毒理学研究小组。地址：Do?wiadczalna街27号，43-200普什奇纳，波兰
摘要
最近，我们开发了一种用于评估眼睛刺激性的细胞毒性测试方法（CEI），该方法能够将物质分类为严重的眼睛损伤、眼睛刺激物或无需分类的物质。OECD 492B方法也可以将物质分为三类。本研究的目的是比较两种将化学品分类为眼睛危害类别的方法：OECD 492B方法和CEI方法。第一种方法按照OECD 492B指南使用SkinEthic人角膜上皮细胞进行测试，第二种方法则使用我们内部的HDFn细胞系进行测试。共测试了18种物质（在OECD 492B方法中以纯形式或20%浓度使用，在CEI方法中分别使用250 mg/mL、50 mg/mL、15.8 mg/mL、5 mg/mL、1.6 mg/mL、0.5 mg/mL的浓度）。通过统计和描述性分析对这两种方法进行了比较。基于有限的化学品数量，对于所有眼睛危害类别，OECD 492B方法的性能指标（如准确性、灵敏度和特异性）与CEI方法相同或更高。然而，CEI方法被认为更具经济效益。由于数据集有限（18种物质），这些结果应被视为初步结果。
引言
化学品接触眼睛后可能会造成伤害。那些对角膜造成严重或不可逆损伤的物质被归类为联合国全球化学品统一分类和标签制度（UN GHS）的第1类（UN, 2023）。其他一些物质可能引起可随时间逆转的变化，例如在兔子体内21天内（OECD, 2023a）。这些化学品被认定为眼睛刺激物，属于第2类。第三类化学品既不属于第1类也不属于第2类，根据UN GHS不需要进行分类。它们对眼睛无害，被称为“无类别”（OECD, 2024a）。正确标注化学品容器非常重要，以便用户了解意外接触这些化学品的危险性。因此，在将化学品投放市场之前，必须对其进行充分测试。长期以来，测试化学品的唯一方法是使用动物。Draize测试于1944年开发（Draize等人，1944年），并于1981年被经济合作与发展组织（OECD）采纳为测试指南405（OECD, 2023a）。该方法仍然可用，但只有在现有信息（包括历史数据、体外/离体研究或计算机模拟评估）不足以正确分类物质时，才能作为最后手段使用（OECD, 2023a；OECD, 2024a）。多年来，虽然开发了许多体外方法，并遵循了3R原则（替代动物实验、减少动物使用数量或改进涉及动物的方法），但这些方法的评估终点各不相同。其中一些方法只能将物质分类为第1类（OECD, 2023b），一些只能分类为“无类别”（OECD, 2024b），还有一些可以同时归类为上述两类（OECD, 2023c），但没有一种方法可以直接将物质分类为刺激物。2017年，OECD发布了关于严重眼睛损伤和眼睛刺激性的综合测试和评估方法（IATA）的第一版（OECD, 2024a），该方法提出了从上到下（首先使用能够将物质归类为第1类的方法）或从下到上（反向研究）的顺序策略（Scott等人，2010）。基于这些策略，OECD开发并采纳了定义明确的方法（DA）（OECD, 2024c）。DA最初于2022年发布，可以将化学品分为三类。目前，OECD TG 467中有三种DA：第一种适用于非表面活性剂液体；第二种适用于非表面活性剂纯液体以及溶于水的液体和固体；第三种适用于纯固体。这些方法结合了体外和计算机模拟技术（OECD, 2024c）。同年，OECD采纳了OECD 492B方法，该方法也可以将化学品分为所有三类，但它是独立使用的（OECD, 2024d）。
OECD TG 492B描述了两种使用重建的人类角膜样上皮细胞的方法（OECD, 2024d）。第一种适用于液体（Alépée等人，2020年），第二种适用于固体（Alépée等人，2021年）。刺激性的强度基于MTT（噻唑蓝四唑溴化物）试验测量的时间依赖性细胞毒性来评估（OECD, 2024d）。
眼睛危害不仅取决于暴露时间，还取决于有害物质的浓度。我们开发了一种新的方法，称为用于评估眼睛刺激性的细胞毒性测试（CEI），该方法基于MTT和NRU（中性红吸收）试验测量的浓度依赖性细胞毒性（Krakowian等人，2021年；Krakowian等人，2022年）。
本研究的目的是比较两种能够将化学品分类为所有三种眼睛危害类别的方法。第一种是OECD 492B方法，第二种是我们内部的CEI方法。通过比较每种测试的基本参数来对比这两种方法。该研究在拥有良好实验室规范证书的卢卡谢维奇研究网络——工业有机化学研究所普什奇纳分部进行，该机构也从事毒性研究。
方法片段
物质和细胞
评估了18种参考物质（表1），包括8种液体和10种固体。这些物质属于每种眼睛危害类别，是从OECD 492B指南中的熟练度物质列表（OECD, 2024d）和CEI方法验证中选出的（Krakowian等人，2021年；Krakowian等人，2022年）。选择这些化学品是因为它们涵盖了广泛的化学类别（表1）。
SkinEthic?人角膜上皮细胞（Episkin #HCE/S/5，批次号23-HCE-059、23-HCE-060、23-HCE-086）被用于OECD测试
物质分类不一致性
使用OECD 492B和CEI方法对物质进行了测试。然后使用ECHA数据库作为参考数据将结果进行比较（表1）。没有一种方法能够正确分类所有物质（表2）。然而，只有一种物质被OECD 492B方法错误分类（苯甲酸钠），其结果被过度预测为第1类。有五种物质在CEI方法中被错误分类。所有错误的CEI结果都是过度预测的（三种从“无类别”被分类为第2类，两种……）
讨论
本研究比较了两种基于人类细胞的体外方法，这两种方法能够将化学品分类为联合国GHS的所有三种眼睛危害类别。我们最近开发了一种新的方法来分类化学品的眼睛危害性。CEI方法（用于评估眼睛刺激性的细胞毒性测试）基于细胞毒性测试。此前，细胞毒性已被用于根据眼睛危害性对物质进行分类（Takahashi等人，2011年），并且已被OECD采纳（OECD, 2023d）。然而，这种方法……
手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
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CRediT作者贡献声明
丹尼尔·克拉科维安（Daniel Krakowian）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、监督、项目管理、方法学、研究、资金获取、形式分析、概念化。普热米斯瓦夫·热姆拉（Przemys?aw ?em?a）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、研究。多米尼卡·冈达罗夫斯卡（Dominika G?darowska）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、项目管理。英格·姆尔兹克（Inga Mrzyk）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督
资助
本工作得到了波兰科学与高等教育部（Ministry of Science and Higher Education）的支持，项目编号为0/23/026/K（EHaP）。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
丹尼尔·克拉科维安报告称获得了波兰科学与高等教育部的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢安娜·丹尼尔-沃伊奇克（Anna Daniel-Wójcik）的支持和建议，感谢米雷拉·基奇卡（Mirella Kieczka）的技术协助，以及金加·格林彼得（Kinga Grynpeter）在论文审稿过程中的帮助。
