基于变异体的计算评估中和抗体对肉毒杆菌毒素A的结合稳定性

《Toxicon》：Variant-aware computational assessment of neutralizing antibody binding robustness to botulinum toxin A

　　Eqram Rahman|Parinitha Rao|Golam Saklayen|Alain Michon|Munim Ahmed|John H. Joseph|William Richard Webb英国伦敦创新美学研究与创新中心摘要A型肉毒杆菌神经毒素（BoNT/A）是一种广泛使用的生物疗法，但天然毒素序列变异对中和抗体结合稳定性的影响仍不甚明了。在本研究中，我们进行了全面的计算分析，以定量评估不同天然存在的BoNT/A变异体之间的抗体结合稳定性。我们利用涵盖所有主要亚型的整理数据集，结合序列变异映射、抗体对接、显式溶剂分子动力学模拟（总时长超过30微秒）、贝叶斯层次模型以及界面网络分析等方法。序列分析显示，氨基酸变异主要集中在溶剂可及区域，轻链核心部分的平均香农熵为0.07，而重链表面环区的这一数值则上升至0.48，且熵值与溶剂可及性之间存在显著关联（Wilcoxon检验p值<10^-6）。抗体对接实验显示，不同变异体之间的能量差异较小（Cohen's d值<0.5），且与动态稳定性指标的相关性也很低（ρ值在0.18–0.31之间）。相比之下，分子动力学模拟揭示了不同变异体对界面稳定性的显著影响，多种变异体的界面均方根偏差（反映结构间原子平均位移的指标）增加了1个标准差以上，同时接触持久性和氢键结合程度也有所下降。通过构建的结合稳定性指数（BRI），可在抗体系统中将高稳定性与低稳定性变异体区分开，两者差异可达2.1至2.7个标准差。贝叶斯模型显示，31–46%的变异体具有较高的后验概率（>0.95），表明其结合稳定性较低。界面网络分析发现，低稳定性变异体会破坏界面的协同结构，高介数残基的损失比例在35–61%之间，模块化程度增加，这一现象与贝叶斯效应估计值高度相关（ρ值=0.74）。这些结果表明，天然的BoNT/A序列变异会导致抗体结合稳定性出现显著差异，这种差异是由界面协同结构的局部破坏而非整体结合力的减弱所导致的。本研究为评估不同毒素变异体间的抗体结合稳定性提供了定量的计算框架，对于理解疗法的持久性及耐药机制具有重要意义。引言A型肉毒杆菌神经毒素是现代医学中最常用的蛋白质疗法之一，广泛应用于神经科、运动障碍疾病、疼痛管理、泌尿科以及美容医学领域（Pirazzini等人，2017；Simpson，1981）。其临床功效源于其对神经元的高度特异性摄取能力以及依赖锌离子的蛋白水解活性，这两种特性使得极低剂量的该毒素就能可逆地抑制神经递质的释放（Tighe和Schiavo，2013）。尽管经过数十年的临床应用且安全性良好，但在部分患者中，BoNT/A疗法的长期效果会因继发性无应答而受到影响，而这通常与中和抗体的产生有关（Bellows和Jankovic，2019；Benecke，2012；Lacroix-Desmazes等人，2017；Mathevon等人，2019；Naumann等人，2013；Rahman等人，2022、2021）。针对BoNT/A的中和抗体通过结合毒素表面的暴露区域，干扰中毒过程的某个或多个环节，包括受体识别、内吞作用、膜转运或细胞内活性等（Rahman和Carruthers，2024）。在临床实践中，抗体介导的治疗失败通常与制剂纯度、累计剂量、注射频率以及辅助蛋白含量等因素相关（Carr等人，2021；Jankovic和Schwartz，1995；Mejia等人，2005）。然而，这种分析框架隐含地将BoNT/A视为结构均匀的目标，未能充分考虑毒素本身存在的自然序列多样性。与这一简化假设相反，BoNT/A并非单一的恒定分子实体。目前已有多种BoNT/A亚型及天然变异体被报道，它们在功能域中存在不同的氨基酸替换，但仍保持相同的折叠结构和催化活性（Hill等人，2007；Peck等人，2017；Smith等人，2007）。结构研究显示，即便有限的序列变异也能改变表面的静电特性、局部灵活性以及各功能域之间的相互作用，而不会影响整体的结构稳定性（Lacy等人，1998；Sharma等人，2010）。从蛋白质-蛋白质相互作用的视角来看，这类变化足以影响抗体结合的稳定性、界面持久性以及构象兼容性。迄今为止，关于BoNT/A免疫相关特性的计算研究主要集中于免疫原性预测，尤其是T细胞表位和HLA限制性肽段呈现模式的识别（Fleri等人，2017；Patronov和Doytchinova，2013；Rahman等人，2025；Raoufi等人，2020）。这些研究有助于了解宿主体内产生抗体的可能性，但并未解决一个至关重要且具有临床意义的问题：一旦抗体产生，它们在不同天然序列变异的BoNT/A毒素上的结合稳定性如何？抗体的有效性并非仅由表位预测决定，还取决于生理条件下抗体-毒素界面的物理稳定性、几何结构以及持久性。由于实际限制，要全面评估不同BoNT/A变异体间的抗体结合稳定性十分困难，这些限制包括难以获取纯化的变异体样本、生物安全考量，以及难以大规模开展标准化的比较结合实验。在此背景下，计算结构建模提供了一种极为合适的方法。随着高分辨率结构数据、蛋白质-蛋白质对接技术、分子动力学模拟以及界面稳定性分析方法的不断发展，如今已能够仅依靠公开数据及纯计算方法，系统地、考虑变异体差异地评估抗体-抗原相互作用（Abali等人，2024；Baskaran等人，2014；Cukuroglu等人，2014；Janin等人，2003；Karaca等人，2022）。重要的是，目前尚不存在一种能够将BoNT/A序列多样性与结构建模相结合，用于评估不同毒素变异体上中和抗体结合稳定性的综合计算框架。这在结构生物学、计算免疫学以及转化治疗学之间存在着明显的空白。填补这一空白对于理解抗体介导的中和作用的差异性、明确导致继发性治疗失败的潜在因素，以及从监管和临床角度为生物制剂的评估提供依据具有重要意义。在本研究中，“结合稳定性”这一术语指的是抗体-毒素复合物在生理条件下的温度波动和溶剂变化作用下，仍能维持稳定、协调相互作用的能力。这一概念既不同于亲和力（单个抗原表位与抗体结合位点之间的平衡结合强度），也不同于亲和力增强效应（由于多价结合而产生的功能增强效应，通常涉及多个抗体结合位点与多个抗原分子结合）。此处所说的稳定性特指单价抗体-抗原相互作用在时间维度上的动态持久性以及界面完整性，可通过接触网络稳定性、对抗构象变化的抵抗力以及协同相互作用的保持情况来评估。结合稳定性降低并不意味着抗体完全无法结合毒素，而是指界面协调性下降，这可能会在抗体需在不断变化的构象环境及竞争环境下持续与毒素结合的体内动态环境中，降低中和效率。本研究的特定目标是计算评估不同天然序列变异的A型肉毒杆菌毒素上中和抗体的结合稳定性。这项工作有两个主要目的：首先，建立并验证一种可用于评估不同毒素变异体间抗体结合稳定性的通用计算框架；其次，生成具有机制解释意义的新数据，阐明天然BoNT/A序列变异如何影响中和抗体的相互作用。为实现这一目标，我们制定了以下研究计划：1. 描述不同BoNT/A变异体之间的序列保守性和变异情况，并将这些特征与已知的三维结构相对应，从而确定与抗体相互作用相关的表面区域。2. 采用一致的对接和结构评估方法，针对选定的中和抗体与代表性BoNT/A变异体之间的相互作用进行建模。3. 利用分子动力学模拟得到的界面稳定性指标，如接触持久性、界面波动性以及相对结合稳定性趋势等，来量化结合稳定性。4. 区分保守的抗体结合区域与易受变异影响的区域，为理解不同毒素变异体之间抗体覆盖程度的差异提供结构依据。需要强调的是，本研究重点关注的是抗体-毒素相互作用的稳定性，即抗体-抗原界面的动态持久性和完整性，而非免疫原性（产生抗体的可能性）或抗体设计。这一区别非常重要：中和抗体的存在与其功能有效性是两个独立的生物学问题，而后者的表现取决于抗体-毒素复合物形成后的物理稳定性。本研究并不推荐任何特定的商业产品，也不对现有疗法做出任何宣称。相反，它提供了一种适用于任何BoNT/A变异体-抗体系统的分析方法，仅依赖公开数据及纯计算手段。所构建的框架旨在帮助从转化角度解读抗体介导的治疗失败现象，为评估疗法的持久性提供计算学依据，并为未来的实验验证奠定基础。通过填补结构生物学、计算免疫学以及转化治疗学之间的这一空白，本研究为理解BoNT/A的免疫相互作用提供了新的视角，而这一视角在以往以免疫原性为重点的研究中并未被涉及。片段内容A型肉毒杆菌神经毒素序列数据集该数据集旨在捕捉A型肉毒杆菌神经毒素的自然分子多样性，同时明确排除了可能干扰抗体-毒素相互作用稳定性分析的实验性、工程化或合成变异体。蛋白质序列取自UniProt知识库，选择该数据库作为主要数据来源，是因为它兼具专家手动整理、稳定的序列编号系统，以及对天然序列与人工改造序列的明确标注功能。BoNT/A序列变异的定量分布情况在整理好的BoNT/A数据集中，序列变异在主链上以及不同结构域中的分布并不均匀。整个毒素序列的平均每个残基香农熵值为0.21±0.18，其中完全保守的区域熵值为0，而表面暴露且变异较大的区域的熵值则超过0.85。按结构域分类来看，变异主要集中在受体结合域以及周边区域的表面可及区域。讨论在中长期使用A型肉毒杆菌毒素疗法时，中和抗体的产生一直是导致继发性无应答的最常见生物学原因之一，但抗体存在与疗法效果下降之间的机制联系至今仍未完全阐明。在神经科和运动障碍疾病领域的临床研究表明，部分患者体内会产生中和抗体，而且这些抗体的存在与疗法效果下降存在关联。结论据我们所知，这是首项运用贝叶斯框架计算分析天然肉毒杆菌毒素变异如何从动态界面网络层面破坏抗体结合的研究，该框架引入了“结合稳定性”这一用于评估疗法持久性的新指标。通过整合序列多样性、结构动力学、统计推断以及机制分析，该研究为理解天然毒素变异如何影响抗体结合提供了清晰且稳健的分析框架。CRediT作者贡献说明William Richard Webb：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，监督，软件使用，资源提供，方法设计，研究实施，正式分析，数据整理，概念构思。John H Joseph：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，监督。Eqram Rahman：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，软件使用，资源提供，方法设计，研究实施，正式分析，数据整理。未引用参考文献UniProt Consortium，2019。利益冲突声明与财务披露声明伦理声明本研究未涉及人类受试者、动物实验，也未使用可识别患者身份的数据。所有研究均通过计算机模拟完成，因此无需伦理审批或知情同意。本研究未进行任何临床操作，也未招募、联系任何人类受试者，更未让其接受任何干预措施。作者确认所有研究方法均遵循相关指南执行。伦理审批与参与同意书无需提供。发表同意书无需提供。数据与材料获取方式如需获取用于支持本研究结论的研究数据，可向相应作者提出请求。资金来源本研究完全依靠作者的个人时间和个人计算资源完成，未获得公共部门、商业机构或非营利组织提供的任何资助，也没有任何机构给予支持。资金状况无需说明。利益冲突声明? 作者声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Rao博士曾担任艾伯维公司旗下Allergan Aesthetics公司的顾问和演讲嘉宾（加利福尼亚州尔湾市）；Michon博士是艾伯维公司旗下Allergan Aesthetics公司的顾问和演讲嘉宾，同时还是Galderma Canada、SkinCeuticals Canada以及欧莱雅巴黎公司的顾问；Joseph博士是艾伯维公司旗下Allergan Aesthetics公司的研究人员及顾问委员会成员（加利福尼亚州尔湾市）。致谢作者衷心感谢Korim Uddin在独立监督下协助完成数据提取、预处理以及模型整合等工作。他的职责仅限于数据管理和计算验证，未参与假设的提出或结果的解释工作。