《Virology》：Development and validation of a dual-fluorescent isothermal enzymatic recombinase amplification assay for the rapid differentiation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus-1 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus-2
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双荧光酶切重组聚合酶扩增（ERA）方法被开发用于同步鉴定和区分PRRSV-1与PRRSV-2，通过ORF7基因保守区设计特异性引物和探针，优化反应条件后实现42℃等温快速检测，灵敏度达10 copies/μL，临床准确率98.78%。
陈安丽|吴光林|王秋梅|康斌|郭海军|孙彦国|张桂红|王恒
中国华南农业大学兽医学院广东省人畜共患病防控重点实验室，广州，510642
摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是导致全球养猪业遭受重大经济损失的主要病原体。PRRSV-1（欧洲型）和PRRSV-2（北美型）两种基因型在遗传特征和流行病学模式上存在显著差异。这两种基因型的共循环和共感染现象日益增多。同时，病毒重组事件持续影响着PRRSV的进化。这些情况共同推动了快速、准确鉴别诊断技术的发展需求。
我们建立并系统优化了一种双荧光酶促重组酶扩增（ERA）检测方法，用于同时检测PRRSV-1和PRRSV-2。选择两种基因型ORF7基因中高度保守的区域作为靶标，设计并筛选了基因型特异性的引物和差异标记的荧光探针。通过正交实验设计优化了反应温度、引物体积比和探针体积比，从而在恒定温度（42°C）条件下实现高效且同步的双靶标扩增。
该检测方法对PRRSV-1和PRRSV-2具有高度的分析特异性，检测限分别为10^2和10拷贝/μL。临床评估显示总体一致率为98.78%。
所开发的双荧光ERA检测方法具有快速反应动力学、操作简便以及高灵敏度和特异性，无需复杂仪器即可可靠区分PRRSV-1和PRRSV-2，为现场诊断、流行病学监测和精准控制PRRS提供了实用高效的工具。
引言
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是影响全球养猪业最具破坏性的传染病之一，其临床表现为母猪繁殖失败和仔猪呼吸系统疾病（Lunney等人，2016年）。其病原体PRRSV是一种包膜单链正链RNA病毒，属于Arteriviridae科Betaarterivirus属，基因组大小约为14.9–15.5 kb（Oh等人，2019年；Yang等人，2019年）。PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞，并通过直接接触、间接接触和垂直传播途径传播。该病毒在猪群中能够建立持续性感染，这使得根除工作尤为困难，因此需要有效的监测和诊断策略（Fan，2019年；Crisci等人，2019年）。在这种情况下，快速准确的PRRSV检测和基因分型是疾病控制、流行病学监测和疫苗策略评估的关键环节。PRRSV分为两种主要基因型：PRRSV-1（欧洲型）和PRRSV-2（北美型），它们的核苷酸序列同源性低于60%。尽管这两种基因型在致病性、毒力和交叉保护免疫方面存在差异，但引起的临床症状几乎相同，因此基于实验室的检测对于准确基因分型至关重要（Wei等人，2019年；Montaner-Tarbes等人，2019年）。自20世纪90年代末以来，PRRSV-2在中国成为主要流行基因型；然而近年来，PRRSV-1的检出率逐渐上升（Charerntantanakul和Pongjaroenkit，2018年；Wei等人，2019年）。当前流行病学现状表现为多种PRRSV基因型和谱系的共循环，以及群体层面的频繁共感染，这大大增加了疾病控制的复杂性，并对病毒检测和分子追踪提出了新的挑战。这些发展凸显了迫切需要能够在检测现场快速可靠地区分PRRSV基因型的诊断工具（Yuzhakov等人，2017年）。
目前，PRRSV的检测主要依赖于血清学和病因学方法，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光试验、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、实时定量PCR（RT-qPCR）和病毒分离（Chaudhari和Vu，2020年；Risser等人，2021年）。其中，RT-PCR和RT-qPCR因其高灵敏度和特异性而被广泛认为是参考标准（Zhang等人，2023年；Pang等人，2023年）。然而，这些技术需要昂贵的仪器设备、稳定的电源和训练有素的人员，并且周转时间较长，这限制了其在现场或农场环境中的应用（Lunney等人，2016年）。在资源有限的环境中，理想的诊断方法应能够实现快速、低成本且准确的基因型区分，无需依赖复杂基础设施。因此，一种能够在现场条件下区分PRRSV-1和PRRSV-2的单管、恒温和快速检测方法仍然是一个亟待解决的问题（Rimayanti等人，2024年）。
酶促重组酶扩增（ERA）是一种先进的恒温核酸扩增技术，基于重组酶聚合酶扩增（RPA）原理。ERA能够在37–42°C的恒定温度下约20分钟内高效扩增，无需热循环，从而减少了对设备的依赖（Wu等人，2024年）。扩增机制涉及重组酶-引物复合物扫描双链DNA以寻找同源序列并启动链交换，随后由单链DNA结合蛋白稳定被置换的链，并通过DNA聚合酶进行指数级扩增。在基于荧光的ERA系统中，目标特异性探针在杂交后被外切酶切割，释放荧光信号，实现扩增过程的实时监测（Stern和Kamp，1989年；Piepenburg等人，2006年；Serrano等人，2021年）。由于这些特性，ERA特别适用于需要快速决策和最小化仪器使用的初级诊断场景。
在本研究中，我们建立并系统优化了一种双荧光ERA检测方法，用于同时检测和区分PRRSV-1和PRRSV-2。选择两种基因型ORF7基因中高度保守的区域作为靶标，设计并筛选了基因型特异性的引物和差异标记的荧光探针。通过正交实验设计优化了关键反应参数，实现了单管内高效且同步的双靶标扩增。该检测方法无需复杂仪器即可快速、敏感且特异性地区分PRRSV基因型，为现场诊断、流行病学监测和精准控制PRRS提供了实用工具。
实验部分
病毒和临床样本
我们在实验室收集了PRRSV-1和PRRSV-2菌株、经典猪瘟病毒（CSFV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪环状病毒（PCV）及其对应的阳性血清和PRRSV-1/PRRSV-2阴性血清，并进行了验证和保存。核酸提取
根据制造商说明，使用Total RNA提取试剂盒（Feijie，上海，中国）提取病毒RNA/DNA。随后使用Evo M-MLV逆转录试剂盒（Accurate）进行逆转录。
双荧光ERA检测法最佳引物对的选择
首先通过PCR扩增PRRSV-1和PRRSV-2的ORF7目标片段，得到预期大小的产物（PRRSV-1为387 bp，PRRSV-2为372 bp；图1A和B）。扩增片段随后被克隆到pMD19-T载体中并通过测序验证。序列分析确认插入片段与预期目标序列一致。以重组质粒pMD19-T-PRRSV-1和pMD19-T-PRRSV-2为模板，评估了九种引物组合。
讨论
PRRSV的防控挑战不仅源于其高突变率和免疫逃逸能力，还源于同一生产系统中PRRSV-1和PRRSV-2的共循环（Nelsen等人，1999年；Shi等人，2010年；Sun等人，2023年）。这两种基因型之间的频繁共感染进一步复杂化了流行病学情况，使得快速准确的基因型区分成为关键技术要求。
数据声明
研究中使用和/或分析的数据集可应要求向相应作者索取。CRediT作者贡献声明
陈安丽：数据整理、正式分析、资金获取、研究调查、方法学。吴光林：数据整理。王秋梅：软件开发。康斌：方法学。郭海军：资源支持。孙彦国：数据整理。张桂红：资源支持。王恒：概念提出、数据整理。利益冲突声明
我们没有任何利益冲突。所有作者均参与了手稿的撰写，并同意发表。致谢
本研究得到了广东省自然科学基金（2025A1515012634）、中国农业部和农业农村部中国农业研究系统（cars-35）以及广东省现代农业产业技术体系创新团队建设项目（2024CXTD15）的资助。
