《Nature Metabolism》：Cell-specific DNA methylation in human alpha and beta cells regulates gene expression in type 2 diabetes
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本研究针对2型糖尿病（T2D）中胰岛α和β细胞特异性表观遗传调控机制不明的关键问题，通过MARIS分选、全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和RNA测序，系统绘制了人类α与β细胞的甲基组和转录组图谱。研究发现了两类细胞间存在大量差异甲基化区域（DMRs），并利用CRISPR-dCas9表观遗传编辑技术验证了DNA甲基化对INS、TH和GCG等关键基因表达的因果调控作用。研究不仅揭示了T2D相关DMRs与GWAS位点的重叠，还发现转录因子ONECUT2在T2D β细胞中表观遗传上调并损害线粒体功能和胰岛素分泌。该工作为理解T2D的细胞特异性发病机制提供了宝贵资源，并提出了潜在的表观遗传治疗靶点。
胰腺中散落着一个个“微型工厂”——胰岛，其中α细胞和β细胞是维持血糖平衡的关键“工人”。α细胞分泌胰高血糖素，负责在饥饿时升高血糖；而β细胞分泌胰岛素，负责在餐后降低血糖。两者功能失调是2型糖尿病（T2D）的核心特征。尽管全基因组关联研究（GWAS）已发现大量与T2D风险相关的遗传变异，但环境因素如何通过表观遗传机制（如DNA甲基化）调控特定细胞类型的基因表达，从而影响疾病进程，仍是一个巨大的“黑箱”。以往的研究大多针对整个胰岛组织，其中混杂了多种细胞类型，难以精确解析α或β细胞特有的表观遗传变化。此外，DNA甲基化的改变是T2D发生的原因还是结果，也缺乏直接的因果证据。为了填补这些知识空白，一项发表于《Nature Metabolism》的研究，对分选纯化的人类胰岛α和β细胞进行了迄今为止最深入的表观基因组和转录组解析。
本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，利用基于细胞内分选的RNA分析方法，从24名（含7名T2D或糖尿病前期患者）供体的胰岛中分选出大量（平均各约30万个）纯化的α和β细胞。随后，对这些分选细胞分别进行了高深度的全基因组亚硫酸氢盐测序，以绘制全基因组DNA甲基化图谱，并进行了RNA测序以分析基因表达。此外，研究运用了基于CRISPR-dCas9系统的表观遗传编辑技术，在人类β细胞系中直接验证特定差异甲基化区域对基因功能的因果影响。研究还整合了已发表的胰岛转录因子结合位点数据、T2D GWAS数据以及三维基因组互作数据，以进行多维度的生物学关联分析。
研究结果
WGBS和RNA-seq揭示人类α和β细胞全局甲基组特征
研究成功获取了高质量的α和β细胞WGBS和RNA-seq数据。分析显示，两类细胞的整体甲基化水平均呈现双峰分布，平均甲基化度分别为76.1%和77.2%。启动子和5‘非翻译区甲基化水平最低，而内含子、3’非翻译区和基因间区甲基化水平最高。研究还发现，在α和β细胞中，启动子/5‘UTR区域的低甲基化与高基因表达相关，而基因体内区域则呈现相反趋势。
α细胞与β细胞间的DMRs及其功能关联
通过比较非糖尿病供体的α与β细胞，研究发现了22，544个DMRs，注释到7，975个基因，其中约50%的基因表达存在差异。这些DMRs富集于胰岛素分泌、cAMP信号、胰高血糖素信号、钙信号通路及T2D等关键通路。包括INS、GCG、PDX1、PCSK1、MAFA、SLC2A2在内的众多关键胰岛功能基因都存在显著的细胞特异性DMRs。这些DMRs区域富集了NEUROD1、FOXA2、PDX1等胰岛重要转录因子的结合 motif，并且与已知的胰岛转录因子结合位点、T2D GWAS风险位点以及既往研究中发现的T2D相关胰岛差异甲基化位点存在显著重叠。
α细胞与β细胞间的差异表达基因
RNA-seq分析鉴定出8，434个α与β细胞间的差异表达基因。其中最显著的差异表达基因富集于胰岛素分泌、T2D、cAMP信号、AMPK信号等通路。其中1，835个差异表达基因同时具有DMRs，提示表观遗传调控在这些细胞特异性基因表达中扮演重要角色。此外，22%的T2D GWAS候选基因在α与β细胞间存在差异表达。
表观遗传编辑验证DNA甲基化对INS、TH和GCG表达的因果调控
为直接验证DNA甲基化的功能，研究在人类EndoC-βH1 β细胞中，利用CRISPR-dCas9-DNMT3A系统靶向增加INS和TH基因附近DMRs的甲基化，导致INS和TH表达下降以及胰岛素含量降低；利用CRISPR-dCas9-TET1系统靶向降低GCG启动子区DMR的甲基化，导致GCG表达和胰高血糖素含量升高。这首次在人类β细胞中直接证明了特定DMRs的DNA甲基化变化可因果性地调控这些关键激素基因的表达。
T2D相关的DMRs在α和β细胞中的发现
比较T2D/糖尿病前期患者与对照的α和β细胞甲基组，分别发现了3，207个和5，106个与T2D状态相关的DMRs。在α细胞中，这些DMRs注释到的基因富集于昼夜节律等通路；在β细胞中，则富集于cAMP、Wnt、钙、PI3K-Akt、FoxO和AMPK等信号通路。值得注意的是，12%和18%的T2D GWAS候选基因分别在α和β细胞中具有T2D相关的DMRs，包括INS、GCG、GLIS3、KCNQ1等关键基因，再次提示遗传与表观遗传在T2D发病中的交互作用。
T2D相关的差异表达基因及ONECUT2的功能验证
在α和β细胞中，分别鉴定出345个和1，037个与T2D状态相关的差异表达基因。其中，转录因子ONECUT2在T2D患者的β细胞中表达上调，且其启动子区域呈现低甲基化状态。在雄性Goto-Kakizaki糖尿病大鼠胰岛中也观察到ONECUT2表达升高。功能实验表明，在β细胞/胰岛中过表达ONECUT2会下调影响胰岛素分泌和葡萄糖稳态的基因集，降低线粒体活性、ATP/ADP比值以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌。这表明ONECUT2是T2D中一个由表观遗传上调、进而损害β细胞功能的新调控因子。
结论与意义
本研究通过高分辨率绘制人类胰岛α和β细胞的特异性DNA甲基化与转录组图谱，极大地深化了对胰岛细胞身份建立和维持的表观遗传基础的理解。研究不仅系统揭示了细胞类型间以及T2D状态下的表观遗传景观，更重要的是通过创新的表观遗传编辑技术，直接证实了DNA甲基化对胰岛素、胰高血糖素等关键激素基因表达的因果性调控，为“甲基化驱动表达改变”提供了直接证据。研究发现T2D相关的表观遗传变化与遗传风险位点高度重叠，为解释T2D的遗传易感性提供了表观遗传层面的机制。特别是鉴定出ONECUT2作为一个在T2D β细胞中表观遗传上调、并损害线粒体功能和胰岛素分泌的负向调控因子，为理解T2D β细胞功能障碍提供了新视角。此外，研究者创建的交互式网络资源“alpha-beta-methylome”，为科学界深入探索年龄、性别和T2D对胰岛细胞表观基因组的影响提供了宝贵平台。总之，这项研究揭示了细胞特异性DNA甲基化在T2D发病机制中的核心作用，不仅增进了对疾病生物学的理解，也为开发针对特定表观遗传靶点的新型疗法奠定了坚实的基础。
