《Scientific Reports》：Highly efficient genome editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein in the marine oleaginous diatom Fistulifera solaris
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为解决产油硅藻基因编辑工具匮乏难题，本研究开发了基于CRISPR/Cas9 RNP的基因组编辑技术。在Fistulifera solaris中实现了apt和dde基因的高效双等位及多重编辑，为微藻生物燃料底盘细胞构建提供了关键技术支撑。
在绿色能源的探索版图中，微藻因其生长迅速、不占用耕地而被视为可持续航空燃料（Sustainable Aviation Fuel, SAF）的理想“生物工厂”。其中，海洋产油硅藻Fistulifera solaris更是天赋异禀，具备极高的脂质积累能力。然而，这把“利器”却长期被困在“基因编辑工具匮乏”的鞘中——由于其独特的异源二倍体（allodiploid）基因组结构，传统的遗传操作手段效率低下，难以精准调控其代谢通路以进一步提升产油效率。为了打破这一瓶颈，研究人员将目光投向了CRISPR/Cas9核糖核蛋白（Ribonucleoprotein, RNP）技术，试图在Fistulifera solaris中建立一套高效、普适的基因组编辑体系，相关成果发表于《Scientific Reports》。
技术路径速览
研究团队主要依托粒子轰击（Particle Bombardment）递送技术，将体外预组装的Cas9蛋白与向导RNA（gRNA）复合物（即RNP）导入Fistulifera solaris细胞。该方法绕过了传统质粒转染在硅藻中可能存在的表达障碍，直接靶向腺嘌呤磷酸核糖转移酶（adenine phosphoribosyl transferase, apt）基因及参与色素代谢的二氮杂黄质去环氧化酶（diadinoxanthin de-epoxidase, dde）基因，通过测序分析验证编辑效率与突变模式。
研究结果
靶向apt基因实现高效双等位编辑
研究首先选取apt基因作为验证靶点。由于Fistulifera solaris为异源二倍体，存在两个同源基因（homoeologs）。实验结果显示，通过RNP复合物靶向apt基因的保守区域，实现了高达87%的双等位编辑效率（即两个同源基因均被成功敲除）。这一结果显著优于许多传统方法，证明了RNP递送策略在该物种中的极高有效性。
多基因协同编辑提升代谢工程潜力
在单基因编辑成功的基础上，团队进一步挑战了多基因编辑（Multiplex genome editing），同时靶向apt基因（作为筛选标记）和dde基因（作为高价值化合物代谢通路代表）。在27个共编辑克隆中，85%的克隆在至少一个dde同源基因上发生了突变，更有63%的克隆在apt和dde基因上均表现出双等位突变。这种高效率的多靶点编辑能力，为同时调控多个代谢节点、协同提升油脂或高价值产物产量奠定了坚实的技术基础。
结论与意义
本研究成功在海洋产油硅藻Fistulifera solaris中建立了CRISPR/Cas9 RNP介导的高效基因组编辑平台。该技术不仅解决了异源二倍体基因组带来的编辑难题，更通过高比例的多重基因编辑，展示了其在硅藻代谢工程与生物燃料底盘细胞优化中的巨大应用潜力。更重要的是，RNP方法避免了外源DNA的整合，且不依赖于物种特异的遗传背景，这为其推广至其他难以转化的非模式硅藻物种提供了可能，是微藻生物技术领域的一项关键工具突破。
