《Scientific Reports》：A method for CRISPR/Cas9-induced genetic barcoding and lineage tracing in sheep
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为解决绵羊胚胎发生、细胞分化与组织再生中细胞命运追踪手段匮乏的问题，研究者利用PiggyBac转座子载体与CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了直接在靶细胞作用的谱系条形码记录方法，证实可获得可遗传克隆标记，为结合单细胞测序开展反刍动物谱系追踪奠定基础。
在生命科学的宏大叙事中，从一个单细胞受精卵发育成拥有数万亿个细胞的复杂个体，是一场精妙绝伦的“细胞分裂与分化之旅”。然而，对于科学家而言，想要看清这场旅途中每一个细胞的“身世”与“去向”——即细胞谱系（Cell Lineage）——并非易事。尤其是在大家畜如绵羊（Ovis aries）中，其发育涉及连续的动态过程，细胞不断增殖、分化并相互协调，但目前用于追踪绵羊胚胎发生、细胞分化和组织再生过程中细胞命运的方法在很大程度上仍未成熟。
传统的谱系追踪手段，如在小鼠等模式动物中使用的染料标记或Cre-LoxP系统，往往面临标记稳定性不足、分辨率有限或难以应用于大动物模型的困境。这种技术瓶颈严重制约了我们对反刍动物发育生物学、器官再生机制以及相关疾病机理的深入解析。为了打破这一局限，研究人员开发了一种基于CRISPR/Cas9的谱系条形码（Barcode）记录方法，该方法能够直接作用于靶细胞，通过在基因组中引入可遗传的编辑痕迹来记录细胞的命运。这一研究成果发表在了《Scientific Reports》上，不仅证实了该方法能在绵羊早期胚胎发育中生成稳定的可遗传克隆标记（Clonal markers），更为未来结合单细胞测序（Single-cell sequencing）技术开展绵羊乃至反刍动物的高精度谱系追踪铺平了道路，为分析胚胎发育、器官再生及疾病机制提供了全新的技术平台。
为了开展此项研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用PiggyBac转poson（PB转座子）载体系统，将合成的连续CRISPR/Cas9靶向阵列引入绵羊基因组的多个位点以形成条形码区域（Barcode region）；通过将Cas9核酸酶整合在绵羊基因组的Rosa26基因位点，在早期胚胎发育的多个时间点诱导条形码区域的编辑；利用高通量检测手段分析发育胚胎中多个整合条形码（intBCs, integrated barcodes）的继承情况，以验证其作为可遗传克隆标记的稳定性。
谱系条形码系统的设计与基因组整合
研究人员首先设计并合成了含有多个连续CRISPR/Cas9靶点的DNA阵列。为了实现这些阵列在基因组的稳定驻留和多位点整合，研究选用了PiggyBac转poson载体系统。该载体能够将外源条形码序列高效地插入到绵羊基因组的不同位点。这些插入的序列形成了“条形码区域”，为后续的编辑提供了固定的靶标。
Cas9整合与早期胚胎中的诱导编辑
为了确保在胚胎发育过程中能实时记录细胞命运，研究团队将Cas9基因整合到了绵羊基因组的保守位点Rosa26基因座。这种策略保证了Cas9能在胚胎的各个细胞及后续发育阶段持续表达。在绵羊早期胚胎发育的多个时间点，表达的Cas9会对已整合的条形码区域进行切割，细胞在修复这些切割位点时会产生随机的插入或缺失（Indels）。
可遗传克隆标记的检测与验证
研究的核心在于验证这些由CRISPR/Cas9诱导产生的编辑是否能稳定遗传。研究人员在发育的胚胎中检测到了多种不同的整合条形码（intBCs），并且证实这些条形码是可以稳定遗传的。这意味着每一个起始的细胞克隆都会携带一个独特的编辑图案（即条形码），其后代细胞将继承这一图案。这种“可遗传的克隆标记”是进行长时程、高精度谱系追踪的基石。
结合单细胞测序的应用潜力
文章指出，该方法所建立的条形码系统，能够很好地与当前的单细胞测序技术兼容。通过在单细胞层面读取这些条形码序列，研究者可以追溯同一个克隆的后代细胞，从而重构细胞谱系树，解析哪些细胞分化为了哪种组织，以及在组织再生过程中细胞是如何响应损伤的。
综上所述，该研究成功建立了一套基于PiggyBac转poson和CRISPR/Cas9基因编辑工具的绵羊细胞谱系追踪方法。通过多位点整合合成条形码阵列及Rosa26位点整合Cas9，研究在绵羊早期胚胎中实现了多时间点诱导编辑，并确认了所产生的整合条形码（intBCs）可作为可稳定遗传的克隆标记。这一技术的建立，填补了反刍动物谱系追踪技术的空白，为今后利用单细胞测序深入探究绵羊胚胎发育动力学、器官再生机制以及疾病发生发展的细胞起源提供了关键的方法学基础，具有重要的科学意义与应用价值。
