《Nature Communications》：Genome-wide screening reveals producer-cell modifications that improve virus-like particle production and delivery potency
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病毒样颗粒(VLPs)是基因编辑工具递送的重要载体，但既往研究多聚焦于颗粒本身的工程化改造，对生产细胞的遗传调控机制关注不足。本研究采用全基因组筛选技术，系统探究了生产细胞基因扰动对工程化病毒样颗粒(eVLPs)产生的影响，发现沉默复合体HUSH与RNA聚合酶III抑制因子MAF1分别是调控蛋白和sgRNA货物表达的关键基因。通过敲除MAF1等基因，研究成功构建了具有更高sgRNA装载效率和生产效力的eVLPs，在多种细胞类型和活体小鼠中均实现2-9倍的递送效率提升。该工作首次从生产细胞工程化角度为VLP优化提供了新策略，具有重要理论与应用价值。
基因编辑技术的快速发展为治疗遗传性疾病带来了前所未有的希望，但如何安全高效地将基因编辑工具（如CRISPR-Cas9系统）递送到体内特定细胞，仍然是制约其临床转化的核心瓶颈。病毒载体虽然高效，但存在免疫原性、潜在整合风险等问题；非病毒载体则往往效率较低。工程化病毒样颗粒（engineered virus-like particles, eVLPs）作为一种新兴的递送平台，巧妙结合了病毒和非病毒载体的优点：它们利用病毒的骨架蛋白来包装和递送基因编辑工具（如核糖核蛋白复合物RNPs），但不携带病毒自身的遗传物质，因此可以实现瞬时、安全的递送。尽管科学家们已对eVLP颗粒本身的组件和结构进行了大量优化，但一个关键问题却被长期忽视：用于生产这些eVLPs的“工厂”——即生产细胞——本身的特性，是否也会深刻影响最终产品的“质量”和“产量”？传统上，eVLPs通过在人类生产细胞（如Gesicle 293T细胞）中瞬时转染相关质粒来生产，这些细胞的状态无疑会影响整个生产过程。然而，此前尚无研究系统探索对生产细胞进行遗传改造，能否超越单纯优化颗粒本身所带来的效益极限。
为了解决这一问题，并系统揭示生产细胞遗传背景对eVLP生产的影响，由Raguram等人领导的研究团队开展了一项创新性研究。他们开发了一种巧妙的无偏性全基因组筛选策略，能够一次性评估成千上万个基因的扰动如何影响eVLP的生产。简单来说，他们让一个混合了各种基因敲除的生产细胞池来生产eVLPs，而每个细胞所产生的eVLP颗粒中，会包裹一个特定的向导RNA（sgRNA），这个sgRNA正好“记录”了该生产细胞自身所携带的基因敲除类型。因此，通过比较不同sgRNA在生产细胞和最终产出的eVLPs中的丰度变化，就能反向推断出对应的基因敲除是促进了还是抑制了eVLP的生产或货物装载。这项研究结果近期发表在顶级期刊《自然·通讯》（Nature Communications）上。
为了开展这项复杂的研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。首先，他们构建并应用了一套基于慢病毒载体、覆盖近2万个人类基因的CRISPR敲除sgRNA文库，在标准生产细胞系中创建了遗传背景各异的单敲除细胞池。其次，他们建立了成熟的工程化病毒样颗粒（eVLP）生产、纯化与体外/体内功能检测平台，包括通过超速离心纯化颗粒、使用ELISA定量颗粒滴度与蛋白装载量、以及通过高通量测序精确量化基因编辑效率。尤为重要的是，他们开发了一套基于模板转换逆转录和独特分子标识符（UMI）的高灵敏度测序流程，用于从eVLPs和生产细胞中捕获并定量sgRNA，从而实现了全基因组水平的筛选与数据分析。此外，研究还利用了包括蛋白质印迹、RT-qPCR在内的分子生物学技术，在细胞和分子水平验证筛选结果并阐述机制。在动物模型中，研究人员通过尾静脉注射将eVLPs递送至小鼠体内，评估了其在肝脏组织中的基因编辑效力。
研究结果
全基因组筛选揭示影响eVLP生产的生产细胞扰动
研究团队首先建立了上述全基因组筛选流程。将携带Cas9和sgRNA文库的慢病毒以低感染复数转导Gesicle 293T生产细胞，获得一个混合的基因敲除细胞池。随后，他们仅转染表达eVLP蛋白组件（gag-ABE融合蛋白、MMLV gag-pro-pol和VSV-G包膜蛋白）的质粒来启动v4腺嘌呤碱基编辑器（ABE）-eVLP的生产，而不额外转染sgRNA质粒。这样，每个细胞产生的eVLP所包装的sgRNA，就是该细胞自身基因组中用于制造敲除的那个sgRNA。通过比较从纯化eVLP中提取的RNA与生产前细胞池RNA中的sgRNA丰度，他们成功绘制了基因敲除对eVLP生产或货物装载影响的全局图谱。分析发现，大多数基因敲除影响不大，少数会降低eVLP产量，而极少数能增加产量。最强的负向调控基因与人类沉默中枢（HUSH）复合体相关，而最强的正向调控基因则是RNA聚合酶III转录抑制因子MAF1。
HUSH相关基因敲除在存在慢病毒Cas9表达时负向影响eVLP sgRNA包装
验证实验表明，敲除HUSH复合体关键基因MPP8、TASOR或MORC2，会导致生产细胞中由慢病毒整合的Cas9表达量大幅上升（mRNA增加5.4-29倍，蛋白增加10-14倍）。这些过量的游离Cas9蛋白会与eVLP的货物蛋白gag-ABE竞争结合sgRNA，导致sgRNA包装进eVLP的效率降低1.5-3.8倍，并最终使eVLP的体外递送效力（EC50）下降2.3-4.4倍。然而，当使用不整合Cas9转基因的eVLP来制造这些HUSH敲除细胞时，sgRNA包装缺陷消失，这表明Cas9的过表达和HUSH敲除共同导致了表型。
HUSH相关基因敲除增加eVLP蛋白货物表达
进一步研究发现，即便在没有整合Cas9的情况下，HUSH敲除细胞在转染eVLP生产质粒后，其gag-ABE蛋白表达量也增加了2.1-4.4倍。这改变了eVLP组件的最佳化学计量比，反而损害了eVLP效力。但通过降低转染质粒中gag-ABE的比例，可以恢复最佳配比，从而挽救效力。更有趣的是，在需要从基因组整合的 cassette 稳定表达gag-ABE（而非质粒转染）的应用场景中，gag-ABE表达通常不足。此时，HUSH敲除带来的表达量提升就成为优势，能将eVLP的递送效力提升4.6倍。
MAF1敲除生产细胞改善eVLP的sgRNA包装
MAF1是RNA聚合酶III转录的抑制因子。敲除MAF1后，由U6启动子（Pol III依赖）表达的sgRNA转录水平增加，导致包装进eVLP的sgRNA丰度增加了2倍，而每个颗粒包装的ABE蛋白数量和颗粒总滴度保持不变。这直接证实了MAF1敲除能特异性提高sgRNA的装载。
MAF1敲除生产细胞在培养细胞和小鼠体内支持更高的eVLP递送效力
得益于sgRNA装载的增加，由MAF1敲除细胞生产的v4 ABE-eVLP，在HEK293T细胞的多个基因组位点（BCL11A, GAPDH, HIRA）的递送效力提升了2.2-2.5倍。更先进的v5 ABE-eVLP（使用进化优化的衣壳）在鼠源Neuro-2a细胞的六个位点，效力提升达2.2-9.1倍。在小鼠体内实验中，低剂量注射由MAF1敲除细胞生产的v5 ABE-eVLP，在肝脏Pcsk9位点的平均碱基编辑效率达到19.4%，显著高于标准细胞生产eVLPs的12.6%。
MAF1敲除生产细胞支持跨货物、颗粒和生产细胞类型的递送效力改善
该策略具有广泛适用性。在另一种常用生产细胞系HEK293T/17中敲除MAF1，同样能提升eVLP效力。此外，由MAF1敲除细胞生产的、包装不同货物（Cas9核酸酶、ABE-NG、TadCBEa）的eVLP，效力均提升约2-2.5倍。更重要的是，该策略对多种非eVLP的RNP递送系统也有效，包括ENVLPE+、miniEDV、RIDE VLP和VEDIC颗粒，效力提升1.7-2.6倍，表明其不依赖于特定颗粒支架或包装机制。
MAF1敲除生产细胞在不同sgRNA表达水平下均能改善eVLP sgRNA包装
研究还发现，单纯增加转染质粒中sgRNA表达盒的数量或比例，对提升效力效果有限。但借鉴“包膜递送载体”策略，在eVLP其他包装质粒上额外添加sgRNA表达盒（++sgRNA），则可以与MAF1敲除产生协同效应，将eVLP中与Cas9复合的sgRNA比例从20%提升至50%，并实现最高的体外编辑效率。
结论与讨论
本研究通过创新的全基因组筛选方法，系统揭示了生产细胞遗传背景对eVLP生产的调控网络，首次将HUSH复合体和MAF1鉴定为调控eVLP蛋白和RNA货物表达的关键因子。基于此，研究人员成功对生产细胞进行了工程化改造：HUSH敲除细胞能在基因组整合表达gag-货物时，将eVLP递送效力提升4倍；而MAF1敲除细胞则能在标准生产条件下，将多种货物、多种颗粒、在不同生产细胞系中生产的eVLPs及相关递送系统的效力提升2-9倍，且该效果在体内小鼠模型中得到证实。
这项研究的意义重大。首先，它开辟了“生产细胞工程化”这一优化VLP及生物颗粒递送系统的新维度，与传统的“颗粒工程化”形成互补。其次，研究发现的MAF1靶点具有普适性，为解决多种VLP系统普遍存在的sgRNA装载瓶颈提供了简单有效的解决方案。通过提升每个颗粒的活性RNP货物数量，该策略能以更低的颗粒剂量实现相同的编辑效果，这不仅降低了潜在毒性风险，也简化了大规模生产的需求。最后，研究所建立的无偏性筛选框架具有高度通用性，未来可用于探索更多类型的遗传或表观遗传扰动，以进一步挖掘生产细胞的优化潜力。总之，该工作深化了人们对VLP生物发生机制的理解，并为最大化基于VLP的基因治疗工具的效用提供了切实可行的新策略。
