《Computational Biology and Chemistry》：An integrated single-cell transcriptomics and explainable AI approach for cancer stemness biomarker discovery in non-small cell lung cancer
编辑推荐：
非小细胞肺癌中罕见癌症干细胞样状态的机器学习与可解释AI分析框架，整合scVI批量校正与CellTypist注释，构建45基因干细胞评分，通过Logistic回归、LightGBM等四类模型筛选出DLL1、ITGA6、ATXN2、NOTCH1、DCLK1、PUM1等关键生物标志物，揭示其在转录调控、细胞粘附等层面的作用机制，为肿瘤可塑性研究提供可复现的方法论。
SharathKumar R. Munisankar | Anand Thiyagaraj
遗传工程系，SRM科学技术学院工程与技术学院，Kattankulathur，Chengalpattu区，泰米尔纳德邦，603203，印度
摘要
非小细胞肺癌（NSCLC）中含有罕见的癌干细胞（CSCs），这些细胞会导致疾病复发和药物耐药性。批量RNA测序（bulk RNA-seq）由于对所有细胞类型的表达进行平均处理，会忽略这些细胞；而标准的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析往往难以可靠地识别这些罕见的CSC状态。为了解决这个问题，我们开发了一个结合机器学习和可解释人工智能（XAI）的scRNA-seq流程，用于检测NSCLC中的CSC样上皮细胞（GSE198099，n=2名患者；尽管统计功效有限，但分析结果得到了基于效应大小的验证支持）。从患者身上获得的scRNA-seq数据经过scVI的质量控制和批量校正，并使用CellTypist进行注释。我们使用了一个45个基因的干性评分来识别候选的CSC样状态。训练了四种机器学习模型（逻辑回归、LightGBM、XGBoost和CatBoost）来完善CSC样状态的识别。基于SHAP的特征归因分析确定了六个关键生物标志物：DLL1、ITGA6、ATXN2、NOTCH1、DCLK1和PUM1。这些生物标志物参与转录调控、细胞黏附、细胞骨架动态和转录后调控。使用TCGA验证数据进行的通路分析为这些生物标志物的生物学相关性提供了支持。该框架提供了一种方法上可重复的方法，能够以更高的机制清晰度揭示罕见的CSC样状态，并为研究NSCLC肿瘤的异质性提供候选生物标志物。
引言
肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占诊断病例的80%以上（Noronha等人，2024年）。尽管靶向治疗和免疫疗法改善了一些患者的预后，但由于肿瘤异质性、疾病复发和治疗耐药性的发展，总体生存率仍然有限（Liu等人，2024年）。越来越多的证据表明，这些挑战部分是由具有干细胞特性的罕见肿瘤亚群引起的，这些细胞通常被称为癌干细胞（CSCs）（Haddadin和Sun，2025年）。
CSCs已被证实与多种癌症类型的转移、免疫逃逸和传统疗法的耐药性有关。这些细胞的特征包括自我更新能力、表型可塑性和肿瘤形成能力（Zheng等人，2022年）。尽管NSCLC中的CSC样细胞与疾病进展的侵袭性和不良预后有关，但它们的分子特征仍然不完整，尤其是在单细胞水平上（Lin等人，2024年）。CSC样状态的识别因它们的数量稀少和动态性质而变得更加复杂，这也阻碍了可靠生物标志物的开发。
批量RNA测序已被广泛用于研究癌症中的转录程序，但这种方法是对异质细胞群体中的基因表达进行平均处理。因此，来自罕见和短暂细胞状态（包括CSC样群体）的信号往往被掩盖（Chang等人，2024年）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过能够在单个细胞水平上进行转录组分析，从而揭示肿瘤内的细胞异质性。然而，标准的scRNA-seq分析策略通常依赖于预定义的标记基因或无监督聚类，由于数据稀疏性、转录噪声以及实体瘤中CSC标记定义的不一致性，这可能不足以可靠地识别CSC样状态（Zheng等人，2022年；Chang等人，2024年）。
机器学习的最新进展显著提高了在高维单细胞数据中的学习和模式识别能力（Brendel等人，2022年）。同时，可解释的人工智能（XAI）方法已被开发出来，用于解释复杂模型并识别驱动预测的特征（Buhrmester等人，2021年）。然而，许多现有的scRNA-seq流程强调预测性能，而没有机制可解释性，或者依赖于可解释性但没有经过稳健的多模型验证。因此，在检测罕见的干细胞样状态和从scRNA-seq数据中推导出生物学上可解释且可重复的生物标志物之间仍存在方法上的差距（Dwivedi等人，2024年）。
在这项研究中，我们通过开发一个结合机器学习和可解释人工智能的集成scRNA-seq分析框架来解决这一差距，以识别NSCLC中的CSC样上皮细胞状态。利用患者来源的scRNA-seq数据，我们应用概率整合方法来校正批量效应并协调细胞群体（Gayoso等人，2022年），然后对肿瘤相关上皮细胞进行重点分析。使用从CSC相关基因衍生的定制复合干性评分来富集具有干细胞样转录特征的细胞（Cheng等人，2024年），并采用多种无监督策略来定义高置信度的CSC样亚群。
为了优先选择稳健的候选生物标志物，我们训练了多个机器学习模型，并应用基于SHAP的特征归因方法来识别在独立机器学习模型中一致贡献于CSC样分类的基因。重要的是，这项研究旨在生成假设。鉴于供体数量有限且缺乏功能验证，我们的目标不是明确识别CSCs，而是提名由模型共识和独立批量转录组数据集的正交验证支持的CSC相关上皮状态和候选生物标志物。
总体而言，这项工作提出了一个可解释的计算框架，该方法具有完全指定的步骤，可以独立实现，用于研究NSCLC中的干细胞样肿瘤细胞状态。通过将单细胞转录组学与可解释建模相结合，这种方法为未来的实验验证、更大规模的多患者单细胞研究以及系统性地研究肿瘤异质性和癌干细胞性奠定了基础。
部分内容
单细胞转录组预处理、聚类和统计功效评估
单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据来自公开可用的NSCLC数据集GSE198099，其中包含来自两名患者的三种组织类型的样本：原发肿瘤组织、邻近正常组织（NAT）和纵隔淋巴结（MLN）。
该数据集包含两名患者，这反映了高质量、公开可访问的NSCLC单细胞RNA-seq数据集及其匹配组织部分的有限可用性。为了评估这种样本量是否足够……
统计功效评估
为了评估样本量的充分性，使用EPCAM表达作为代表上皮细胞的标志物，进行了事后统计功效分析。肿瘤、邻近正常组织和纵隔淋巴结样本之间的成对比较显示出较大的效应大小（Cohen’s d = 0.983–2.455），表明生物学信号分离明显。然而，相应的统计功效值仍然较低（0.094–0.292），反映了样本量的有限性……
讨论
在非小细胞肺癌中解析CSC样状态需要超越描述性转录组分析的方法，以实现稳健性、可解释性和生物学上的可解释性。在这项研究中，我们提出了一个集成的单细胞分析框架，结合了概率建模、多模型分类和可解释的人工智能（XAI），以在统计上严格和……
本研究的局限性
在解释研究结果时，应考虑本研究的几个重要局限性。首先，此处分析的单细胞RNA-seq数据来自非常少的患者。尽管分析了数千个细胞，但事后功效分析确认由于生物学重复次数少，统计功效仍然有限。有限的供体数量限制了研究结果的普遍性，并增加了患者特异性效应的可能性。
结论
在这项研究中，我们提出了一个集成的单细胞转录组和可解释人工智能框架，旨在以透明和可重复的方式优先识别非小细胞肺癌中的CSC样上皮状态。通过结合概率潜在表示、多模型分类和基于归因的特征排序，所提出的方法解决了批量转录组分析和黑盒预测模型在探究罕见细胞状态时的局限性。
伦理声明
本研究不涉及任何人类参与者、动物实验或临床试验。所有分析都是在公开可用的数据集上进行的，不需要伦理批准。
未引用的参考文献
(Ang等人，2023年；Babu等人，2022年；Fan和Waldmann，2024年；Kim等人，2024年；Pancewicz-Wojtkiewicz等人，2017年)
资助
本研究由SRM科学技术学院的Selective Excellence Research Initiative (SERI)资助，资助项目编号为SRMIST/R/AR(A)/SERI2024/174/35。
CRediT作者贡献声明
Anand Thiyagaraj：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、概念化。SharathKumar R. Munisankar：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法论设计、调查、正式分析、数据管理、概念化。致谢
作者衷心感谢SRM科学技术学院的教职员工和研究人员提供的坚定支持和基础设施，这使本研究成为可能。我们还要感谢遗传工程系提供的必要计算资源和项目指导。
我们还要感谢SRM科学技术学院遗传工程系的Swati Swagatika Sethy博士对本文的贡献。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Anand Thiyagaraj报告称获得了SRM科学技术学院（被视为大学机构）的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者衷心感谢SRM科学技术学院的教职员工和研究人员提供的坚定支持和基础设施，这使本研究成为可能。我们还要感谢遗传工程系提供的必要计算资源和项目指导。
