《Developmental & Comparative Immunology》：Comprehensive and comparative investigation of immune signalling pathways in the larval gut of Zophobas morio based on transcriptome sequencing
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本研究通过转录组分析揭示了拟步甲Zophobas morio幼虫肠道中先天性免疫相关基因，涉及MAPK、Toll、IMD等信号通路，并探讨其作为模式生物在免疫机制研究中的应用价值。
Ramanathan Nivetha | Mani Meenakumari | Ayikkara Peroor Mahi Dev | Sundaram Janarthanan
分子昆虫学单元，马德拉斯大学动物学系，Guindy校区，金奈 - 600025，印度
摘要
超虫Zophobas morio是一种甲虫，广泛分布于有腐烂有机物质的环境中，是储藏食品的常见次级害虫。其幼虫阶段生活在腐烂环境中，因此预计它们具有独特的免疫适应性，这对于它们在这种环境中的生存至关重要。通过对Z. morio整个肠道组织的转录组分析，本研究系统地调查了参与先天免疫系统不同途径的转录本。该研究在昆虫的整个肠道组织中发现了113个与先天免疫机制相关的转录本。其中，39个转录本参与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，24个参与Toll信号通路，12个参与免疫缺陷（IMD）通路，4个参与Janus激酶激活信号转导子和转录激活因子（JAK/STAT）通路，另有34个转录本参与其他与免疫相关的过程。对免疫相关基因的分析显示，在Z. morio幼虫肠道转录组中，约四分之一的转录本与相关甲虫群体以及人类免疫系统具有同源性。此外，通过对Z. morio与其他昆虫之间免疫基因保守域的鉴定，发现了它们之间存在深度系统发育关系和共同的进化祖先，这通过结构和功能同源性得到了证实。了解参与生物系统（如免疫）的重要功能基因之间的相似性，无疑有助于将昆虫作为出色的体内实验模型生物。
引言
在生命史上，昆虫进化成了最成功的生物群体之一，它们具有极强的适应性，能够在多种生态变化中生存，并且几乎存在于地球上的每一个可想象的栖息地中（Hillyer, 2016）。在促成它们成功的原因中，复杂的免疫系统尤为突出，这种系统有助于识别、中和和消除病原体（Sheehan et al., 2020）。与其他无脊椎动物一样，昆虫缺乏提供特定病原体受体和相关记忆的适应性免疫机制，但它们的防御仍然依赖于高度进化且高度保守的先天免疫系统，这种系统的强大性和特异性超出了先前的预期（Gomes et al., 2022）。包括细菌、病毒、真菌、原生动物甚至其他昆虫在内的多种病原体经常对它们的生存构成威胁（Vega and Kaya, 2012; Hillyer, 2016）。由于它们的本质，这种相互作用永远不会形成“双赢”局面，昆虫依靠强大的先天免疫系统来对抗所有这些威胁。除了物理屏障外，昆虫还利用细胞事件（如吞噬作用、结节形成和包裹作用）以及由脂肪体、血细胞、肠道、唾液腺和其他组织介导的体液事件来对抗感染（Ratcliffe and Rowley, 1979; Gupta, 1991; Hillyer, 2016）。在昆虫中，免疫反应始于病原体的识别，这是启动免疫反应的关键步骤。随后是细胞外级联反应的调节、免疫信号通路的启动以及免疫相关机制的诱导，最终导致入侵病原体的消灭（Hoffmann et al., 1999; Shao et al., 2017）。识别步骤可以激活免疫信号通路，这些通路可以（i）增强免疫反应，（ii）刺激抗菌分子的产生，以及（iii）增强效应机制（Hillyer, 2016）。在昆虫中，主要的信号通路包括MAPK、Toll、IMD和JAK/STAT。
鉴于高等生物和昆虫具有相似的信号通路和组分，昆虫是研究先天免疫和宿主-病原体相互作用机制的有效体内模型（Yu et al., 2022）。人们认识到，脊椎动物的免疫机制和昆虫的防御系统具有许多共同特征（Vilmos and Kurucz, 1998）。例如，Drosophila和脊椎动物在先天免疫反应中共享许多信号通路和生物过程（Harnish et al., 2021）。此外，包括Galleria mellonella、Manduca sexta和Bombyx mori在内的多种昆虫被广泛用于研究病原体的毒力，因为它们与哺乳动物的免疫反应有相似之处（Sheehan et al., 2018）。作为昆虫纲中最大的目，鞘翅目昆虫因其丰富的物种组合而经常被用于免疫学研究（Takov et al., 2022）。基本免疫系统的共同特征，如病原体识别和Toll、JAK/STAT等分子信号通路，使得鞘翅目昆虫成为生物医学研究中的流行实验模型，每种机制都有脊椎动物对应物，有助于详细研究包括人类在内的哺乳动物免疫系统的进化起源（Altincicek et al., 2008）。
近年来，越来越多的昆虫物种，尤其是鞘翅目昆虫，被用作生物医学研究中的理想模型生物，因为它们分布广泛、生态重要性高且易于饲养（Adamski et al., 2019）。此外，与其他昆虫目相比，甲虫保留了更多的祖先基因，这些基因在高级水平上与哺乳动物类似物具有相似性（Van der Zee et al., 2008; Gooptu and Lomas, 2009）。本研究旨在对Zophobas morio幼虫肠道中的各种免疫信号通路进行转录组分析，这种甲虫占据多种栖息地，是储藏食品的次级害虫。除了帮助我们理解各种免疫信号机制外，从Z. morio转录组中收集的大量数据对我们理解脊椎动物的比较特征具有重要意义。因此，研究结果可能非常关键，因为它有可能将这些发现外推到脊椎动物，并进一步证实Z. morio作为模型生物在生命科学各个领域的实际应用价值。
部分片段
总RNA的分离与分析
使用Tritol（Rio et al., 2010）从Z. morio幼虫的整个肠道组织中分离总RNA。使用RNA HS测定试剂盒（ThermoFisher Scientific #Q32851）在Qubit荧光计（ThermoFisher Scientific #Q33238）上分析了分离出的RNA的数量。使用Nanodrop 1000检测了分离出的总RNA的纯度。使用TapeStation 4150和HS RNA筛选条获得了样本的RNA完整性数（RIN）。
基于
Illumina平台的RNA测序、从头组装和功能注释
使用...
RNA提取与定量
提取的RNA的数量和纯度在补充表1和补充图1中呈现。样本的RNA完整性数（RIN）值也提供给了大家。在文库制备之前，样本经过了一轮纯化处理。
文库的制备
最终文库的定量结果在补充表2和补充图2中呈现。提供了文库的插入片段大小。所有文库都被认为是合格的。
讨论
本研究对Z. morio幼虫整个肠道组织的转录组分析使用了单一生物重复样本作为探索性研究。即使在定性转录组分析（特别是RNA-seq）中，也很难证明使用单一生物重复样本的合理性，因为很难估计生物变异。鉴于这一限制，本研究试图调查幼虫肠道中参与免疫信号通路的基因
结论
对Z. morio幼虫肠道组织中各种免疫信号通路的转录组分析显示，这些通路与重要昆虫模型Tenebrio molitor和Tribolium castaneum的大多数免疫相关基因有密切关系。对参与免疫功能的蛋白质氨基酸序列的分析表明，从Z. morio转录组数据中选出的某些转录本在结构上与人类相关。总之，这些结果...
CRediT作者贡献声明
Ramanathan Nivetha：撰写——原始草稿、项目管理、方法论、调查、正式分析。Mani Meenakumari：软件、方法论、数据管理。Ayikkara Peroor Mahi Dev：验证、软件、方法论、数据管理。Sundaram Janarthanan：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理、概念化
未引用的参考文献
Huang and MacKerell Jr, 2013; O'Neil et al., 2013; Yu et al., 2022.
数据可用性
本研究使用的大部分数据包含在本手稿和补充文件中。如有需要，可以提供额外数据。
生成式AI声明
作者在撰写本手稿或任何其他目的中均未使用任何生成式AI。
致谢
Ramanathan Nivetha衷心感谢马德拉斯大学通过Kalaignar M. Karunanidhi捐赠奖学金（2019–2022年，参考编号F.11-Endow/Ph.D. Scholarship/2018–19/712，日期2019年5月21日）提供的奖学金。作者还感谢马德拉斯大学动物学系在DST-FIST基础设施下的支持。
