基于结构的工程方法对超嗜热古菌中的转录调节因子EnfR进行改造，以增强氢气（H2）的产生

《International Journal of Hydrogen Energy》：Structure-based engineering of the transcriptional regulator EnfR in a hyperthermophilic archaeon to enhance H2 production

通过理性设计改造极端嗜热古菌T. onnurineus NA1的转录因子EnfR的DNA结合域，筛选出R44A突变体（MC21菌株）。转录组分析显示CO和糖类发酵相关基因（codh、mbh）显著上调，该菌株在CO及CO与麦芽糊精共培养条件下，生物量产量分别提升1.28和2.32倍，最大产氢速率提高1.79和2.26倍，验证了结构生物学指导的转录因子工程对提升产氢效率的有效性。

　　

李成赫|裴大元|李成默|车顺真|李正民|姜成均|李贤淑

韩国海洋科学技术院（KIOST）海洋生物技术与生物资源研究部，韩国釜山，49111

摘要

先前的研究表明，通过改变EnfR的DNA结合区域（EnfR是一种对codh基因簇表达至关重要的新型抑制因子），可以影响Thermococcus onnurineus NA1中与H₂生成相关的基因表达。在本研究中，基于EnfR的结构进行了合理设计，以增强CO依赖性的H₂生成。通过EnfR的结构建模预测出多个突变位点，最终选择了R44A突变，并构建了MC21菌株（EnfR-R44A）。对MC21菌株在CO条件下的转录组分析显示，参与CO和糖发酵生成H₂的基因表达上调。为了评估其对细胞性能的影响，将MC21菌株的生长和H₂生成能力与野生型菌株在多种培养条件下的表现进行了比较。有趣的是，MC21菌株的生长速率与野生型菌株相当。此外，在CO单独培养或添加麦芽糊精的条件下，其生物量生产率分别提高了1.28倍和2.32倍，H₂生成率分别提高了1.79倍和2.26倍。我们的研究强调了通过基于结构的工程改造转录调控蛋白来提升H₂生成微生物细胞工厂的潜力。

引言

氢（H₂）作为应对气候变化的替代能源受到关注；然而，市场上大部分氢气仍来自化石资源。虽然生物氢的生产目前主要局限于实验室规模，仅有少数试点研究[[3], [4], [5], [6], [7]]，但微生物产氢技术提供了成本更低、环境影响更小的替代方案。可持续的原料供应以及提高H₂的产量和生产效率对于使生物氢生产在经济上可行至关重要。一氧化碳（CO）通过各种工业过程（包括废物/生物质气化和钢铁制造过程）大量产生，约2.49亿吨[8]，并已被广泛研究用于生物转化成多种有价值的代谢物[9]。然而，关于CO依赖性生物氢生产的研究仍然有限[10]，需要更高效的微生物平台。

尽管已有少数微生物被成功应用于商业生产，如重组蛋白和乙醇的生产以及多种氨基酸的合成，但大多数微生物为嗜温菌，这可能导致大规模生产过程中的问题，例如由于原料灭菌不完全而引发污染。极端微生物能够在高温环境下生存，其独特的生化和生理特性为生物技术应用提供了机会[11,12]。此外，多极端微生物通过直接进化、启动子工程和CRISPR工具等手段，可以增强其对温度、pH值和盐分的耐受性[13]。然而，各种（超）嗜热菌的生物过程和遗传系统仍处于初级阶段[14]。

Thermococcus onnurineus NA1是一种超嗜热古菌，于2006年从PACMANUS海域的深海热液喷口区域分离得到[15]。该菌株的基因组编码了7种不同的氢化酶基因，能够以高产率从CO、甲酸盐和淀粉中生成H₂[16], [17], [18]]。与催化水-气转移反应（WGS）不同，T. onnurineus NA1中的CO依赖性H₂生成过程能够产生渗透离子势，最终与ATP合成耦合[2,18,19]。为了利用该菌株的潜力，开发了一种基于天然海水的连续生物氢生产工艺[10]。此外，通过代谢工程和适应性进化，该菌株的CO依赖性H₂生成能力得到了显著提升[20,21]。特别是通过适应性进化获得的156T菌株，其H₂生成率比野生型高出2.2倍[21]。这一性能提升主要归因于转录调控因子EnfR中的T55I突变，该突变减轻了对CODH基因簇的抑制作用。EnfR的结构分析表明，T55I替换显著降低了其DNA结合亲和力[22]，为通过EnfR工程增强CO依赖性H₂生成提供了可能。因此，EnfR是一个有前景的调控靶点，对其合理改造有望进一步调整全球转录调控机制，从而提高H₂生成效率。然而，尽管在增强T. onnurineus NA1的CO依赖性H₂生成方面取得了显著进展，但尚不清楚是否可以通过系统性的转录因子工程来重新编程全球调控网络，从而进一步改善超嗜热古菌的氢生产。

转录因子（TF）工程已被用于重新编程细胞内的全球调控网络，以响应内部或环境信号，显著调节基因表达[24,25]。通过修改天然或合成的转录因子，可以增强微生物的耐受性、调控通量，并微调调控网络以提升代谢产物的生成[26], [27], [28], [29]]。当与途径工程、系统生物学和蛋白质工程结合使用时，转录因子工程可以显著提高微生物细胞工厂的适应性、稳健性和生产效率，从而应用于工业生物技术。在本研究中，我们结合结构信息应用转录因子工程来增强羧基营养条件下的H₂生成。基于EnfR的DNA结合亲和力分析，选择了R44A突变作为关键突变，并在T. onnurineus NA1中构建了携带该突变的突变菌株（MC21，如我们之前所报道的[22]）。我们进行了转录组分析，以了解与H₂生成增强相关的生理反应，这是首次在超嗜热古菌中应用转录调控因子工程来改善H₂生成的案例。

MC21菌株的克隆与构建

根据制造商的协议（Bionics，韩国首尔），使用EcoRI和HindIII限制性内切酶，合成并克隆了一个在位置44处将精氨酸替换为丙氨酸（R44A）的EnfR蛋白基因，将其插入pUC57-Amp质粒中。通过PCR扩增突变后的enfr基因并纯化后进行亚克隆。为了构建与T. onnurineus NA1兼容的载体，将纯化的突变enfr基因及其两侧各1 kb的片段通过一步法连接起来

EnfR的DNA结合结构建模

在我们之前的研究[22]中，电泳迁移率分析（EMSA）显示T55I突变体仍具有可检测的DNA结合亲和力，而R44A突变体的结合能力几乎完全丧失。与此一致，本研究中半定量密度计分析进一步证实了所有变体之间的DNA结合行为存在明显差异。在5–200 nM蛋白质浓度范围内，野生型和T55I突变体的结合能力均呈现浓度依赖性增强

讨论

本研究通过结构分析、转录组分析和生理实验确定，Arg44是T. onnurineus NA1中EnfR介导的DNA识别和转录调控的关键决定因素。基于Arg44而非Thr55作为主要调控残基的假设（因为它直接参与DNA识别），我们发现对其的靶向改造能够引起显著的全球转录重编程并提高H₂生成

结论

在本研究中，通过对T. onnurineus NA1中的转录调控蛋白EnfR进行结构建模和突变分析，增强了H₂生成能力。携带R44A突变的MC21菌株在CO条件下表现出基因表达的显著变化。特别是，其codh和mbh基因簇的表达增强，这两个基因簇分别参与CO和糖的利用来生成H_{22生成能力均得到了提升}

CRediT作者贡献声明

李成赫：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、概念构建。裴大元：初稿撰写、数据可视化、方法验证、数据管理。李成默：初稿撰写、数据分析。车顺真：审稿与编辑、方法验证、实验设计、概念构建。李正民：初稿撰写、结果验证。姜成均：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了韩国海洋科学技术院（KIOST）内部项目（EA0411和EA0413）的支持。