《Metabolic Engineering》：Multifaceted metabolic engineering of Streptomyces hygroscopicus for milbemycins overproduction
编辑推荐：
提高斯氏链霉菌SIPI-054产米尔贝霉素A3/A4的效率，通过三步代谢工程策略：首先删除三个竞争途径提升基础产量34.2%；其次整合1-3个米尔贝霉素生物合成基因簇（BGC）拷贝，使产量再提升71.1%-112.8%；最后利用quorum sensing响应的sbbAp启动子驱动CRISPRi动态调控三羧酸循环和脂肪酸合成关键节点，实现碳流自主平衡。最终工程菌株摇瓶产量达6.14 g/L，较原株提高3.4倍，验证了多策略协同优化的有效性。
Jiafeng Xu|Guosong Zheng|Bin Ni|Jiajie Zhang|Delin You|Shaoxin Chen|Wenfang Wang|Yinhua Lu
上海师范大学生命科学学院，上海，200234，中国
摘要
米尔贝霉素是一种由16个成员组成的大环内酯类抗生素，其结构与阿维菌素相似，在农业和兽医害虫控制方面具有重要的应用价值。然而，其工业生产受到发酵产率较低的制约。为了解决这一问题，我们采用了一种迭代的多步骤策略来改造Streptomyces hygroscopicus SIPI-054菌株以增加米尔贝霉素的产量。首先，通过删除三个竞争性代谢途径，米尔贝霉素A3/A4的产量提高了34.2%。其次，通过位点特异性重组整合了一个到三个额外的米尔贝霉素生物合成基因簇（BGC），产量进一步提高了71.1%，达到112.8%。最后，我们利用群体感应（QS）响应性启动子sbbAp来驱动CRISPRi技术，调控关键的初级代谢节点，包括三羧酸循环中的柠檬酸合成酶gltA和脂肪酸合成途径中的β-酮酰-ACP合成酶fabH。经过改造的最佳菌株在摇瓶培养条件下实现了迄今为止报道的最高米尔贝霉素A3/A4产量（6.14?g/L），比起始菌株提高了3.4倍。总体而言，这项工作展示了一种强大的工程策略，结合了竞争性代谢途径的消除、基因剂量放大以及动态调控的CRISPRi技术，有效地重新编程了微生物的代谢过程，为Streptomyces天然产物的工业化生产提供了一个可推广的框架。
引言
米尔贝霉素是由多种Streptomyces物种产生的16元大环内酯类抗生素，包括Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739（Baker等人，1996年）、Streptomyces bingchenggensis（Xiang等人，2007年）和Streptomyces nanchanggensis（Wang等人，2013年）。在米尔贝霉素家族中，化合物A3和A4对螨虫、线虫和多种昆虫害虫具有最强的广谱活性，并且具有较低的哺乳动物毒性和良好的环境相容性（Yan和Xia，2021年）。此外，米尔贝霉素肟（milbemycin oxime）作为米尔贝霉素A3/A4的半合成类似物，已被广泛用于治疗宠物寄生虫（Kim等人，2017年）。尽管这些化合物具有重要的价值，但工业生产菌株主要是通过随机突变技术开发的，包括紫外线照射、N-甲基-N′-硝基-N-硝基胍（NTG）化学诱变、乙基甲磺酸酯（EMS）以及常温和室温等离子体（ARTP）处理。这些方法显著提高了产量，例如在S. bingchenggensis中实现了约80%的产量提升（Wang等人，2009年）。然而，这些方法存在随机性和劳动强度高的问题。此外，长时间的突变积累最终会导致产量停滞，有益突变的频率降低，进一步改进变得困难。因此，合理的代谢工程已成为释放这些工业微生物生产潜力的关键工具（Wang等人，2014年）。
为了解决工业菌株产量停滞的问题，合理的代谢工程开发了一系列策略，以在多个层面上优化细胞工厂：消除基因组冗余、最大化生物合成能力以及优化碳流分布。首先，基因组简化是一种基础策略，可以简化代谢网络。删除非必需或竞争性的生物合成基因簇（BGC）可以显著减轻代谢负担，并将细胞内的能量和共同前体重新定向到目标产物。这一策略的有效性得到了许多成功案例的支持。例如，经过简化的Streptomyces coelicolor M1152菌株缺乏四个活性BGC，其产生的抗生素（如氯霉素和康戈霉素）的产量比野生型菌株高出20-40倍。在基因组减少的Streptomyces avermitilis中，删除约15%的非必需基因组不仅提高了阿维菌素的产量，还增强了遗传稳定性（Ikeda等人，2014年；Komatsu等人，2010年）。
其次，增加目标BGC的基因剂量已成为提高化合物产量的有效方法。例如，在Streptomyces pristinaespiralis中，通过多重位点特异性基因组工程（MSGE）整合了一个到五个BGC拷贝，显著提高了普里斯塔霉素II的产量，达到2.2?g/L（Li等人，2019年）。同样，在异源宿主中，高拷贝整合也取得了显著效果；在Streptomyces albus J1074中整合四个staurosporine BGC拷贝后，产量比野生型菌株提高了30倍（Zhang等人，2023年）。Liu等人在< />属中展示了组合方法的力量，通过增加acarbose BGC的拷贝数（2、3和4个拷贝），产量有所提高；特别是含有四个拷贝的菌株结合系统代谢工程和分批发酵后，产量达到了8.12?g/L（增加了3.2倍）（Liu等人，2025年；Liu等人，2025年）。
第三，最近开发了动态调控策略，可以自主重新分配碳流，从而平衡细胞生长和产物合成，提高目标化合物的产量。例如，在S. avermitilis中，通过使用相位依赖性启动子pkn5p驱动的CRISPRi电路动态调控脂肪酸合成途径和TCA循环，阿维菌素B1a的产量提高了20.3%（M. Yang等人，2024年）。在Streptomyces rapamycinicus中，EQCi系统将内源群体感应系统（QS，γ-丁内酯响应机制）与CRISPRi结合，实现了低成本、多目标和自主调控，使雷帕霉素的产量提高了约660%（Tian等人，2020年）。
虽然这些单独的策略——基因组简化、BGC扩增和动态调控——都已被证明非常有效，但它们在工业Streptomyces菌株中的系统性和组合应用仍然很大程度上未被探索。在这项研究中，我们首次建立了一个综合的多方面代谢工程框架，同时结合了这三种方法来重新编程工业菌株S. hygroscopicus SIPI-054，该菌株本身就具有较高的米尔贝霉素A3/A4产量基线。首先，多组学分析指导了三个竞争性BGC的敲除，以简化代谢途径。随后，我们使用MSGE技术整合了1-3个额外的米尔贝霉素BGC拷贝，从而增加了生物合成流量。最后，实施了动态调控电路，利用顺序启动子sbbAp来驱动CRISPRi介导的TCA循环和脂肪酸合成途径中关键代谢节点的下调，从而在不抑制细胞生长的情况下自主平衡碳流。这三种策略的协同整合最终使工程菌株的米尔贝霉素A3/A4产量达到了6.14?g/L，比亲本菌株提高了3.4倍，验证了一种用于工程化工业放线菌的强大方法（图1）。
菌株和生长条件
S. hygroscopicus SIPI-054及其衍生物在MB琼脂培养基（蔗糖4?g/L、脱脂奶粉1?g/L、酵母提取物2?g/L、琼脂20?g/L、pH 7.2）上培养以制备孢子，并在M-ISP4培养基（胰蛋白胨2?g/L、酵母提取物1?g/L、大豆粉5?g/L、甘露醇5?g/L、淀粉5?g/L、(NH4)2SO4 2?g/L、K2HPO4 1?g/L、CaCO3 2?g/L、NaCl 1?g/L、缬氨酸0.5?g/L、FeSO4 0.1?mg/L、MnCl2 0.1?mg/L、ZnSO4 0.1?mg/L、琼脂20?g/L）上培养，并添加100?mM MgCl2以促进基因间的共轭反应
多组学分析确定S. hygroscopicus SIPI-054中的竞争性代谢途径
产生米尔贝霉素的S. hygroscopicus SIPI-054菌株是通过多轮物理和化学突变从野生型菌株NRRL 5739（无基因组序列）衍生而来的。在此，我们进行了全基因组测序，揭示了SIPI-054的基因组序列长度为12,063,392 bp，GC含量为70.72%，与另一种产生米尔贝霉素的菌株S. bingchenggensis BCW-1的基因组相似（Wang等人，2013年）
讨论
工业微生物生产菌株的改造传统上依赖于迭代随机突变。尽管这种方法成功产生了高产菌株（如S. hygroscopicus SIPI-054），但不可避免地会导致“产量停滞”，表现为有害突变的积累和基因组结构的紊乱（Cho等人，2019年；Lum等人，2004年；Zhuo等人，2010年）。在这项研究中，我们证明了要克服这一限制需要采取新的方法
CRediT作者贡献声明
Jiafeng Xu：概念构思、数据整理、研究、方法学、初稿撰写。Guosong Zheng：研究、方法学。Bin Ni：研究、方法学。Jiajie Zhang：方法学。Delin You：资金获取、审稿与编辑。Shaoxin Chen：资源支持。Wenfang Wang：监督、初稿撰写。Yinhua Lu：资金获取、监督、审稿与编辑。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2019YFA0905400）、国家自然科学基金（32270095）以及微生物代谢国家重点实验室的开放资助项目（MMLKF24-08）的支持。
