利用35S:RUBY和CRISPR/LbCas12a系统，对籼稻的体外再生和农杆菌介导的转化进行基因型特异性优化

《Planta》：Genotype-specific optimization of in vitro regeneration and Agrobacterium-mediated transformation in indica rice with 35S:RUBY and CRISPR/LbCas12a system

建立基于CRISPR/LbCas12a和RUBY报告器的印度稻种基因转化系统，优化了callus诱导（最高达90%）和再生条件，Kon Joha转化效率达15.33%，验证了RUBY的非侵入性监测效果。

　　

摘要

主要结论

本研究利用35S:RUBY和CRISPR/LbCas12a构建体，为indica水稻品种Ranjit、Mahsuri和Kon Joha建立了一种基因型特异性的转化系统，从而实现了功能基因组学研究和遗传改良。

摘要

indica水稻亚种在功能基因组学和遗传改良方面面临诸多挑战，这主要是由于其难以进行组织培养和农杆菌介导的转化。本研究选择了在印度阿萨姆邦种植的三个indica水稻品种Ranjit、Mahsuri和Kon Joha，以优化愈伤组织的诱导、再生及遗传转化过程。Ranjit和Mahsuri是高产品种，而Kon Joha是一种具有较高商业价值的本土芳香型地方品种。首先，使用成熟种子优化了Ranjit和Kon Joha的愈伤组织诱导和再生关键步骤。随后，由于未成熟胚胎具有农杆菌感染能力，选择未成熟胚胎作为外植体进行转化实验。在Ranjit和Kon Joha中，分别使用3.0 mg L^?1和3.5 mg L^?1的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）获得了最高的愈伤组织诱导率（70.33%和90%）。最佳的再生效果在Ranjit（77%）和Kon Joha（54.5%）中是通过使用4.0 mg L^?1的6-苄氨基嘌呤（BAP）、1.0 mg L^?1的激动素（kinetin）和0.5 mg L^?1的萘乙酸（NAA）实现的。利用CRISPR/LbCas12a的转化效率（OD₆₆₀ = 0.8）分别为Ranjit的5.6%、Mahsuri的7.5%和Kon Joha的15.33%。之前为Ranjit确定的最佳体外再生条件也被应用于Kon Joha的转化实验。此外，还使用了一种可视化的非侵入性报告基因RUBY来观察Ranjit和Kon Joha未成熟胚胎的转化情况。在愈伤组织形成早期出现的鲜艳红色表明转化成功。从红色愈伤组织中再生的Kon Joha植株表现出独特的表型特征，表现为粉红色的叶子和红色的根系。这些发现证实了RUBY作为快速监测水稻转化的非侵入性报告基因的有效性，并强调了未成熟胚胎在indica水稻转化中的重要性。