开发了一种基于离子对反相分离和亲水相互作用的多重高效二维液相色谱技术，用于分析治疗性寡核苷酸中的杂质

《Journal of Chromatography A》：Development of Multiple Heartcutting Two-Dimensional Liquid Chromatography with Ion-Pairing Reversed-Phase and Hydrophilic Interaction Separations for Analysis of Impurities in Therapeutic Oligonucleotides

本研究通过将离子对反相色谱（IPRP）与水合相互作用色谱（HILIC）结合的二维液相色谱法，有效分离了20-30核苷酸的合成寡核苷酸（ONs）及其氧化、脱氟等杂质。优化了活性溶剂调制条件，解决了传统方法中峰形重叠和灵敏度不足的问题，实现0.1%相对主峰量的检测灵敏度。

　　

Daniel Meston|Matt Sorensen|Todd Maloney|Dwight Stoll

美国明尼苏达州圣彼得市古斯塔夫阿道夫学院化学系，邮编56082

摘要

随着基于RNA的药品在临床应用中的不断增长，创新的分析方法对于评估这些复杂治疗分子的质量属性至关重要。合成寡核苷酸（ONs），如小干扰RNA和反义寡核苷酸，是一类日益重要的基因药物，通常由20到30个核苷酸组成的单链或双链RNA或DNA分子构成。由于合成寡核苷酸相对较大的分子尺寸、多阴离子性质以及可能存在的多种合成修饰和杂质，对其进行分析存在相当大的挑战。越来越明显的是，传统的色谱方法并不总能完全解析这些样品中的所有杂质成分。二维液相色谱（2D-LC）是一个潜在的有效解决方案，它通过第二维度的互补分离，能够快速分辨出在第一维度中共同洗脱的物种。在这项工作中，我们探讨了在第二维度中使用HILIC分离作为第一维度离子对反相分离（IPRP）补充方法的潜力。利用一个23个核苷酸的替代寡核苷酸及其几种密切相关的结构作为潜在杂质，我们发现IPRP和HILIC分离的选择性具有高度互补性，因此适合用于二维分离格式。此外，在所研究的条件下，这两种分离方法的负载能力相似，这为用户在选择第一维度使用哪种分离方法时提供了灵活性。然后，我们展示了如何使用迭代保留模型方法系统地发现所需的第二维度梯度，以分辨出在第一维度柱中共同洗脱的物种。出乎意料的是，我们发现在使用活性溶剂调节（Active Solvent Modulation）时必须优化界面条件，因为最弱的稀释剂（例如HILIC分离中的高ACN浓度）并不总是能获得最佳的第二维度分离效果。最后，我们为两种不同的寡核苷酸序列开发了IPRP-HILIC方法，这些方法能够提高之前共同洗脱的杂质的分辨率，并在相对于全长产品的0.1%浓度下实现足够的检测灵敏度。

引言

治疗性寡核苷酸（ONs）的研究、开发和商业化，如反义寡核苷酸和小干扰RNA，持续增长，并为治疗多种疾病带来了希望[1,2]。这些合成寡核苷酸通常长20到30个核苷酸，采用固相寡核苷酸合成技术制备[3]。评估寡核苷酸的质量属性（如纯度和序列）对于确保产品疗效和患者安全至关重要。由于其复杂的化学结构，需要创新的分析技术来充分表征它们[4]。

高效液相色谱是一种强大的分析工具，可用于确定寡核苷酸中的杂质并识别其降解产物，例如添加物、缺失、氧化和脱嘌呤[5,6]。已采用多种色谱模式进行寡核苷酸分离，包括离子对反相（IP-RP）、亲水相互作用（HILIC）、阴离子交换（AEX）、混合模式（MM）和尺寸排阻色谱（SEC）[5,7]，以及非传统的相（例如胆固醇和聚对苯二甲酸乙二醇酯），这些相可以实现无需离子对的反相分离[8]。IP-RP具有高分辨率能力、对不同离子对试剂的灵活性，以及多种商业化的反相固定相选择[9]。疏水性离子对试剂（例如三丁胺、二丁胺、己胺）可以增强峰容量并抑制磷硫酯寡核苷酸的不需要的非对映体分离[10,11]。较少疏水性的离子对试剂（例如丙胺、二乙胺、二丙胺）可用于分辨位置异构体和立体异构体或核碱基变体[[12], [13], [14]]。

最近的研究综述文章[15], [16], [17]总结了HILIC分离相对于IP-RP的独特优势。HILIC不使用离子对试剂或有毒的氟醇，使用挥发性流动相添加剂，并在洗脱时使用高比例的有机溶剂，这可能在使用电喷雾电离的质谱检测时提高离子化效率。与IP-RP和AEX相比，HILIC对某些杂质具有独特的选择性[18,19]。在HILIC条件下，氧化杂质（磷硫酯键到磷酸二酯键，PS-PO）和脱氟杂质会在全长产物（FLP）之后洗脱，而在IP-RP和AEX方法中，这些杂质会在FLP之前洗脱。无论哪种情况，这些杂质通常会与缺失杂质（对于IP-RP和AEX）或添加杂质（对于HILIC）共同洗脱。

二维液相色谱方法通过结合不同的色谱模式，改善了寡核苷酸的分离和检测[20]。这些实现包括RP与IPRP[21]、AEX与IPRP[22,23]、IPRP与AEX[24]、AEX与HILIC[22]、IPRP与IPRP[25,26]、MM与RP[7]、RP与HILIC[8]、IPRP与HILIC[22]，以及IPRP或HILIC后接SEC[27]。一些最近的例子涉及结合SEC后接IPRP，以同时确定siRNA双链的非变性纯度和变性纯度[28]。开发了一种选择性的全面手性x IPRP 2D分离方法，与一维分离相比，该方法将分离出的磷硫酯寡核苷酸的非对映体数量增加了一倍[29]。最近还开发了一种AEX x HILIC方法，用于磷酸二酰胺吗啉寡聚体的杂质分析[30]。作为第二维度分离的HILIC提供了独特的优势。首先，上述提到的质谱优势使得无论第一维度条件如何，都能直接进行质谱耦合。其次，低粘度溶剂可以降低第二维度的背压，从而允许更高的分析通量或使用更长的柱子。将IPRP的分辨率能力与HILIC的互补性和质谱友好性结合起来，可以增强寡核苷酸的分离效果，尽管在2D-LC分离中结合IPRP和HILIC的报道很少[22]。

我们之前关于寡核苷酸的2D-LC研究使用了IPRP在两个维度中的方法，并采用迭代建模方法快速优化梯度洗脱条件，从而增强了寡核苷酸杂质的分离[25]。当前手稿描述的工作目标是研究在第一维度使用IPRP、在第二维度使用HILIC的2D-LC分离的性能。我们首先评估了IPRP和HILIC之间的负载能力和选择性互补性。然后，我们研究了在活性溶剂调节（ASM）过程中洗脱剂组成对分辨率的影响，以优化IPRP和HILIC的耦合。最后，利用寡核苷酸对流动相组成的敏感性[31]，在2D系统的每个维度中实施了独特的梯度条件。这种设置改进了在一维HILIC或IPRP分离中共同洗脱的缺失（n-1）、添加（n+1）、氧化（PS-PO）和脱氟杂质的分离效果。

最近，Aebischer、Abdurahaman和Guillarme发表了一篇关于IPRP×HILIC分离寡核苷酸“全突破”方法的简短通讯[32]。他们指出，这是一种解决2D-LC中溶剂不匹配问题的替代方法，该方法避免了使用“复杂仪器”。他们在这项工作和其他相关论文中表明，这种方法可以为保留在给定第二维度分离中的分析物质量部分提供可接受的峰形。然而，我们认为这种方法不适合用于药物分析，如杂质分析和峰纯度评估。在这样的分析中，我们的目标是尽可能多地色谱分离样品中的化合物，并确保检测到所有存在的成分（即质量平衡），通常可达到主要成分的0.1%。像全突破方法那样将分析物的质量分为未保留部分和保留部分，会引入分析风险，包括：1) 多个分析物可能共同洗脱，导致在第二维度柱的空体积中产生共洗脱；2) 分析物质量分割程度的小变化可能影响定量精度；3) 由于分析物质量的分割，灵敏度降低。在这些工作中，这些风险太大而无法接受，特别是在制药实验室中通常使用无需峰分割的商用解决方案来解决问题时[[33], [34], [35], [36]]。

化学品和试剂

寡核苷酸标准品（LR/HP序列；见表1）购自Biosynthesis Inc.（德克萨斯州刘易斯维尔）。超纯水（18.2 MΩ）使用Millipore公司（马萨诸塞州伯灵顿）的Milli-Q Advantage A10水纯化系统（Z00Q0V0T0）自制。二丁胺（DBA，>99%）购自TCI（美国俄勒冈州波特兰）。乙酸（≥99%）、乙腈（ACN，HPLC级）、醋酸铵（≥99%）和1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP，≥99%）也来自同一家公司

具有相似序列的寡核苷酸的IPRP和HILIC分离的互补性

先前的研究表明，HILIC分离的分辨率通常低于IPRP分离[22,37,38]。然而，在二维分离的背景下，即使分离模式的分辨率较低，只要其选择性足够互补，能够分离出另一种分离方法无法分离的物种，也是足够的。为了评估本工作中IPRP和HILIC分离的互补性，我们进行了比较

结论性评论

随着大多数主要制药公司在研发管线中越来越多地使用寡核苷酸（ONs），目前以一维分析为主的方法已经不足以完全表征这些高度复杂的混合物。因此，二维液相色谱（2D-LC）提供了一种在不大幅牺牲样品通量的情况下提高分离性能的手段。在这项工作中，我们探讨了将HILIC与IPRP结合用于多维分离的潜力

作者贡献

Daniel Meston：数据收集、手稿初稿准备、结果分析和解释、审稿与编辑；

Matt Sorensen：数据收集、样品制备、手稿初稿准备、结果分析和解释；

Todd Maloney：样品制备、手稿初稿准备、结果分析和解释；

Dwight Stoll：资金获取、手稿初稿准备、结果分析和解释、审稿与编辑。

作者贡献声明

Daniel Meston：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学研究、数据分析、概念化。

Matt Sorensen：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学研究、数据分析。

Todd Maloney：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、资源获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

图1、图2、图3、图4和图5中的数据是使用Agilent Technologies提供的仪器和柱子收集的。D.S.部分得到了美国国家科学基金会（CHE 2003734）的资助。