超临界方法转移：三家SFC仪器制造商间的资格认证与比较

《Journal of Chromatography A》：Super critical method transfer: Inter-manufacturer qualification and comparison of three SFC instruments

超临界流体色谱（SFC）方法转移受仪器差异影响显著，本研究通过对比Waters UPC2、Shimadzu Nexera UC和Agilent 1260 Infinity II SFC的梯度精度、注射重复性及溶剂系统，验证了三种仪器在分离维生素A乙酰酯异构体任务中的可行性。结果表明，尽管SFC系统稳定性低于液相色谱，但通过系统参数优化和差异补偿，成功实现跨品牌方法转移。

　　

莫·莱盖利（Mo Legelli）| 迈克尔娜·维尔茨（Michaela Wirtz）| 斯特凡·拉莫特（Stefan Lamotte）

波恩-莱茵-西格应用科学大学自然科学系，冯·李比希街20号（Von-Liebig-Str. 20），53359莱因巴赫（Rheinbach），德国

摘要

与液相色谱（LC）不同，在超临界流体色谱（SFC）中，仪器设置和配置的微小变化都可能影响溶剂密度，从而导致选择性变化。因此，方法转移的过程比LC更为复杂。此外，不同制造商的仪器在操作模式上的差异也会影响实验结果。本研究首先在Waters UPC2仪器上开发了相关方法，随后在岛津（Shimadzu）的Nexera UC系统和安捷伦（Agilent）的1260 Infinity II SFC系统上进行了方法验证。通过系统的质量评估，对比了这三台仪器的性能。我们进行了梯度测试，以评估梯度准确性和精确度，并确定了各系统的停留体积和泵的运行性能。此外，还评估了注射重复性，从而了解了各系统的注射方式以及不同制造商对实验结果的影响。由于安捷伦系统采用样品进料注射方式，而岛津仪器支持共注射功能，因此特别关注了如何最小化溶剂强度对分离效果的影响。基于这些实验，我们将维生素A醋酸酯的构型异构体分离方法转移到了所有三台仪器上进行验证。尽管SFC的稳定性相对较低，但实验结果证明了方法转移的可行性，并展示了SFC技术的特点。同时，本研究还概述了仪器的不同选项以及设置差异对分离效果的影响。

引言

在超临界流体色谱（SFC）中，方法从一台仪器转移到另一台仪器，尤其是在不同品牌之间的转移，并非易事[1,2,3]。SFC一直被认为是一种稳定性不如液相色谱（LC）的技术，这在方法转移过程中尤为关键[2,4,5]。造成这种看法的主要原因是，在SFC中，选择性不仅受固定相和流动相以及温度的影响（如LC中的情况），还受到系统内压力的影响。由于超临界CO₂的溶剂强度与其密度相关，系统压力的变化（例如由于管路差异）可能会影响分离结果[4]。因此，在比较不同仪器或制造商时，即使技术规格相同，也可能对结果产生影响。这些规格可能包括注射方法或洗脱液引入系统等。在一种仪器上开发的方法可能不适用于另一种仪器，从而影响实验性能。因此，在评估结果时，由于条件不同，可能缺乏合适的参数比较框架，导致比较结果产生误导。然而，在某些情况下，更换仪器或制造商是必要的，例如在方法验证、实验室间测试或遇到技术问题时需要进行稳定性检查。本研究不仅展示了不同类型仪器之间的方法转移能力，还通过预先进行的质量评估实验，指出了针对每种仪器需要考虑的因素。

已有许多研究尝试对比不同制造商的SFC仪器[1,5,6]，这些研究反驳了该技术不可靠和稳定性不足的论断。本研究通过系统的方法对三种主要的分析型SFC仪器（Waters UPC2、岛津Nexera UC和安捷伦1260 Infinity II SFC）进行了质量评估和比较，以支持这一观点。

为此，需要明确这些仪器之间的差异。主要差异包括CO₂泵（特别是在冷却和背压调节方面）、注射方法以及洗脱液引入系统。

首先来看CO₂泵：Waters和安捷伦仪器通过珀尔帖元件（Peltier element）对CO₂泵进行电冷却，而岛津则使用冷却液进行冷却。背压调节方式不同，Waters和安捷伦采用动态弹簧或活塞机制，岛津则使用可调节开口的隔膜。虽然这些差异对性能影响不大，但可能会影响仪器的使用寿命和能耗，以及是否需要额外的冷却装置[7,8]。

另一个显著差异在于注射技术和自动进样器功能。Waters和岛津的SFC自动进样器采用流通注射方式，类似于常见的LC系统，即泵流将样品直接引入系统而无需稀释[9]。岛津仪器甚至支持与另一种溶剂共注射，例如使用较弱的共溶剂进行“夹心注射”（sandwich injection），这可以在样品稀释剂浓度远高于流动相时减少溶剂强度不匹配的问题[10]（因为SFC要求样品在注射前必须溶解在超临界CO₂中）。在共注射过程中，样品会被较弱溶剂稀释，从而缓解溶剂强度不匹配的问题。这种技术有助于改善峰形。然而，这也引入了许多优化注射过程的因素，如共溶剂的类型、样品与共溶剂的体积比及其顺序（共溶剂是在样品之前还是之后注入）。在这种情况下，总注射体积受到限制，因为只能注入循环系统的容量。因此，实现共注射可能需要多个实验步骤[7]。不过，许多商用自动进样器（如岛津的Nexera UC）支持这种注射模式。而Waters的UPC2仪器（至少在其使用的软件版本中）不支持共注射。

一些自动进样器（尤其是安捷伦的SFC专用进样器）支持进料注射，以减少溶剂强度不匹配的问题。在这种模式下，样品在循环系统中预先压缩后再注入溶剂流中，从而与洗脱液混合。这对于强溶剂注射非常有利。在梯度分离条件下，这一功能可以充分发挥作用；但在等度分离模式下，则可能导致谱带变宽。安捷伦的多功能自动进样器同时支持常规注射和进料注射，但在SFC应用中只能使用进料注射模式。尽管如此，仍有一些参数可以用来控制注射过程，例如调整进料速度可以改善混合效果，但会导致谱带变宽。此外，冲洗（overfeed）溶剂的量和清洗步骤也会影响分离效果[9]。

最后是洗脱液引入方式的不同。Waters仪器采用二元泵模块，包含一个用于CO₂的泵头和一个用于有机溶剂的泵头，一次只能输送一种溶剂，限制了其LC模式下的等度分离能力。岛津和安捷伦都声称其仪器具有混合功能，这意味着除了SFC模式外，它们还可以用于纯LC分离（梯度洗脱）。不过，两种仪器的构造不同：安捷伦仪器与Waters类似，使用二元泵分别输送CO₂和有机溶剂；而Waters的UPC2仪器则无法进行共注射。

本研究旨在评估这三台仪器的梯度分离和注射性能。这些实验将为将维生素A醋酸酯（VAA）异构体的分离方法从Waters仪器转移到其他制造商的仪器上提供基础。

仪器介绍

在超临界流体色谱（SFC）中，方法从一台仪器转移到另一台仪器，尤其是不同品牌之间的转移，是一个复杂的过程[1,2,3]。SFC常被认为稳定性不如LC，这在方法转移时尤为明显[2,4,5]。主要原因在于SFC的选择性不仅受固定相、流动相和温度的影响，还受系统压力的影响。由于超临界CO₂的溶剂强度与其密度相关，系统压力的变化（如管路差异）会影响分离结果[4]。因此，在比较不同仪器或制造商时，即使技术规格相同，也可能导致结果差异。这些差异可能涉及注射方法或洗脱液引入系统等。在一种仪器上开发的方法可能不适用于另一种仪器，从而影响实验性能。因此，在评估结果时，可能需要适当的框架来进行参数比较。

已有研究对比了不同制造商的SFC仪器[1,5,6]，证明了该技术的稳定性和可靠性。本研究通过系统的方法对三种主要SFC仪器进行了质量评估和比较，进一步证实了这一观点。

为此，需要明确这些仪器之间的差异。主要差异包括CO₂泵（冷却和背压调节）、注射方法以及洗脱液引入系统。

首先，Waters和安捷伦仪器使用珀尔帖元件电冷却CO₂泵，而岛津使用冷却液。背压调节方式不同：Waters和安捷伦采用动态弹簧或活塞机制，岛津则使用可调节开口的隔膜。这些差异对性能影响不大，但可能影响仪器的使用寿命和能耗。

另一个差异在于注射技术和自动进样器功能：Waters和岛津的SFC自动进样器采用流通注射方式，而岛津的自动进样器允许与另一种溶剂共注射。例如，在使用较弱共溶剂的情况下，这种技术可以减少溶剂强度不匹配的问题。在注射过程中，样品会被较弱溶剂稀释，从而改善峰形。然而，这也引入了许多优化因素，如共溶剂的类型、体积比及其顺序（共溶剂是在样品之前还是之后注入）。在这种情况下，总注射体积受到限制。

最后是洗脱液引入方式的不同：Waters仪器使用二元泵模块，一次只能输送一种溶剂，限制了其LC模式下的应用范围。岛津和安捷伦的仪器都支持混合模式（SFC和LC）。安捷伦仪器类似于Waters，使用二元泵分别输送CO₂和有机溶剂；而在LC模式下，需要额外配置LC泵并通过阀门切换两种模式。岛津仪器在SFC模式下使用两个独立的泵模块：一个用于CO₂，另一个用于有机溶剂。在LC模式下，使用相同的泵输送洗脱液，只需禁用CO₂泵即可。这种设计的优点是SFC模式下无需预混合，可以直接输送混合溶剂。

本研究的目标是评估这三台仪器的梯度分离和注射性能。这些实验将为将维生素A醋酸酯异构体的分离方法从Waters仪器转移到其他制造商的仪器上提供依据。

仪器详情

仪器

本研究使用了三家不同制造商的SFC系统：Waters的Acquity UPC2（美国马萨诸塞州米尔福德市）。该方法在Acquity UPC2仪器上开发，包括收敛管理器（C2M）、二元溶剂管理器（C2B）、样品管理器–FL（C2S）、柱管理器（CMP）和光电二极管阵列（PDA）检测器（C2P）。此外，还使用了Waters的Acquity Ultra Performance LC系统及其C2P蒸发光散射检测器（ELSD）进行糖类分析。操作和数据记录通过Empower 3软件完成。

结果与讨论

结果分为两部分呈现：首先比较了三台仪器的仪器质量评估测试结果；随后详细讨论了方法在仪器间的转移过程。

结论

研究表明，尽管这三台仪器在构造上存在差异，但它们都适用于SFC分离。所有评估的仪器都能有效分离视黄醇醋酸酯异构体。与预期相反，方法转移是可行的，且无需调整即可获得可用的高质量结果，未来还有进一步优化的潜力。这一点尤为重要。

作者贡献

莫·莱盖利（Mo Legelli）：方法设计、指导、数据整理、可视化、初稿撰写； 迈克尔娜·维尔茨（Michaela Wirtz）：指导； 斯特凡·拉莫特（Stefan Lamotte）：概念构思、方法设计、资源获取、项目管理、指导、审稿与编辑。

资助

本研究得到了BASF SE的“科学和技术成就认可”（STAR）计划的资助。

数据声明

研究数据可向相应作者索取。

作者贡献声明

莫·莱盖利（Mo Legelli）：初稿撰写、可视化、指导、方法设计、数据整理； 迈克尔娜·维尔茨（Michaela Wirtz）：指导； 斯特凡·拉莫特（Stefan Lamotte）：审稿与编辑、指导、资源获取、项目管理、方法设计、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成利益冲突的财务关系：斯特凡·拉莫特表示获得了BASF SE的财务支持。其他作者声明没有已知的可能影响论文结果的财务关系或个人利益。

致谢

作者感谢安捷伦（特别是Edgar N?gele和Svenja Schaudel）和岛津（特别是Philipp Jochems和Gesa Schad）在实验过程中提供的支持和帮助。