与乳酸分泌奶牛瘤胃中可利用的脂肪酸、日粮特性及瘤胃发酵相关的甲烷排放变化——一种荟萃分析方法

《Journal of Dairy Science》：Variations in methane emissions associated with rumen accessible fatty acids, dietary characteristics, and ruminal fermentation in lactating dairy cows – a meta-analytical approach

　　亨德拉·努尔·卡约（Hendra Nur Cahyo）| 埃米亚斯·凯布雷亚布（Ermias Kebreab）| 玛丽·贝丝·德·昂达尔扎（Mary Beth de Ondarza）| 维尼修斯·卡内罗·德·索萨（Vinícius Carneiro de Souza）| 安吉拉·施瓦姆（Angela Schwarm）
挪威生命科学大学动物与水产科学系，奥卢夫·特森斯大街6号（Oluf Thesens vei 6），奥斯1433，挪威

**摘要**
本研究旨在定量总结哺乳期奶牛甲烷（CH4）排放量与日粮中可进入瘤胃的脂肪酸（RAFA）、日粮组成、动物特征及瘤胃发酵之间的关系。研究数据来源于48篇经过同行评审的文献，共包含180个处理组的结果，这些文献记录了添加脂质的哺乳期奶牛的CH4排放情况。日粮中的RAFA包括C12:0、C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、顺式-C18:1、反式-C18:1、C18:2和C18:3。研究者构建了混合效应回归模型，将研究本身作为随机效应纳入模型，并根据观察均值的标准误差倒数对回归结果进行加权处理。通过一致性相关系数、与研究相关的估计方差σ^s和误差σ^e、修正后的赤池信息量准则值（AIC）以及观测均方误差的标准化比率来比较不同模型。结果表明，每增加10克/千克总日粮RAFA，日甲烷产生量（g/d）、产量（g/kg DMI）和强度（g/kg ECM）分别线性下降26%、0.92%和0.90%。然而，某些脂肪酸（如C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1和C18:2）的抑制效果在较高添加水平下会减弱，显示出二次剂量-反应关系。相比之下，C12:0和C18:3等其他脂肪酸在整个剂量范围内均表现出线性抑制效应。单独分析各脂肪酸发现，CH4排放主要受C12:0、C14:0、C16:0、顺式-C18:1、C18:2和C18:3的影响。日粮中的淀粉和可进入瘤胃的醚提取物与CH4产生量（g/d）及产量（g/kg DMI）呈负相关。DMI和NDF的消化率是能够较好解释CH4排放变化的动物变量。瘤胃参数（如总VFA浓度和乙酸盐与丁酸盐的摩尔比例）与CH4产生量呈正相关，而丙酸盐的摩尔比例则与CH4产量和强度（g/kg ECM）呈负相关。模型比较显示，仅考虑RAFA无法完全解释CH4排放的变化。包含动物变量（如DMI和NDF消化率）的模型具有更强的解释能力，暗示脂肪补充对CH4产生的间接效应。进一步分析表明，当纳入瘤胃变量后，CH4产量和强度的模型解释能力得到提升，这表明在预测CH4排放的模型中需考虑这些因素。此外，研究还观察到交互作用现象：在日粮中淀粉含量超过20%或NDF含量不超过35%的情况下，中链脂肪酸（C12:0、C14:0和C16:0）对CH4排放的抑制作用更为显著。

**解释性总结**
脂肪补充会改变奶牛的甲烷排放，但特定脂肪酸的贡献尚未明确。研究表明，日粮中可进入瘤胃的脂肪酸总量与甲烷排放之间存在负相关和二次相关关系。然而，结合脂肪酸特征、动物特征和瘤胃发酵变量能更准确地解释甲烷排放的变化。分析还发现，在淀粉含量高（>20% DM）且纤维含量低（≤35% DM）的日粮中，中链脂肪酸对甲烷排放的抑制作用更明显。

**引言**
近几十年来，脂肪补充的应用范围从原本主要用于提高乳脂率和产奶量（Palmquist和Jenkins，2017）扩展到减少奶牛的肠道甲烷（CH4）排放（Arndt等人，2022；Beauchemin等人，2022；Martins等人，2024）。脂肪抑制甲烷排放的机制涉及多种途径，包括抑制产甲烷菌和原生动物活动、通过生物氢化作用提供氢气替代途径，以及脂肪替代可发酵有机物（Newbold等人，2015；Beauchemin等人，2022）。不过，脂肪补充的减排效果受脂肪添加量、脂肪酸组成和浓度以及脂肪物理形态（如油、整粒种子、压碎种子、挤压种子、裂开种子）的影响（Martin等人，2008；Patra，2013；Martins等人，2024）。先前研究显示，日粮中脂肪每增加10克/千克DM，CH4产量（以g/kg DMI计）可减少3.8%至4.3%（Patra，2013, 2014），最高可达5.6%（Beauchemin等人，2008）。研究表明，菜籽油、亚麻籽油、葵花籽油、椰子油和鱼油中的中链脂肪酸（MCFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）在减少肠道甲烷排放方面更有效（Beauchemin等人，2009；Pirondini等人，2015；Bayat等人，2018）。脂肪可以以未经处理的形式（如整粒种子）或经过加工的形式提供，后者通常在瘤胃中的利用率更高（Beauchemin等人，2022）。为考虑生物利用度的差异，研究者引入了“可进入瘤胃的脂肪酸”（RAFA）的概念，以反映脂肪酸被瘤胃微生物利用的速度（Esposito等人，2020）。未经过充分处理的脂肪来源（如整粒种子）对瘤胃发酵的影响较低，而经过处理的脂肪则能增强其对肠道甲烷的抑制作用（Esposito等人，2020；de Ondarza等人，2024）。例如，Martin等人（2008）发现，尽管粗亚麻籽和挤压亚麻籽的脂肪含量和脂肪酸组成相似，但前者使CH4排放分别减少了11.6%和38%。

**引言（续）**
过去几十年，脂肪补充的应用从主要提升乳脂率和产奶量（Palmquist和Jenkins，2017）拓展到减少奶牛的肠道甲烷排放（Arndt等人，2022；Beauchemin等人，2022；Martins等人，2024）。脂肪的甲烷抑制作用源于多种机制，包括抑制产甲烷菌和原生动物活动、通过生物氢化提供氢气替代途径，以及脂肪替代不可在瘤胃中发酵的有机物质（Newbold等人，2015；Beauchemin等人，2022）。然而，脂肪补充的减排效果受添加量、脂肪酸组成和浓度以及脂肪物理形态的影响（Martin等人，2008；Patra，2013；Martins等人，2024）。已有研究显示，日粮中脂肪每增加10克/千克DM，CH4产量可减少3.8%至4.3%（Patra，2013，2014）甚至高达5.6%（Beauchemin等人，2008）。菜籽油、亚麻籽油、葵花籽油、椰子油和鱼油中的中链脂肪酸和多不饱和脂肪酸被认为更有效（Beauchemin等人，2009；Pirondini等人，2015；Bayat等人，2018）。脂肪可以以未加工或加工形式提供，其中加工后的脂肪在瘤胃中的利用率通常更高（Beauchemin等人，2022）。为考虑生物利用度的差异，引入了“可进入瘤胃的脂肪酸”（RAFA）的概念。

**引言（再续）**
de Ondarza等人（2024）的元分析应用RAFA概念，更准确地反映了不同脂肪形态对甲烷排放的影响。研究显示，每单位中链脂肪酸（MCFA，C12:0，C14:0，% DM）、多不饱和脂肪酸（PUFA：C18:2和C18:3，% DM）和不饱和脂肪酸（UFA：C18:1，C18:2，C18:3，% DM）的增加会导致肠道甲烷排放分别减少5.06%、6.88%和4.65%。不过，不同脂肪酸调节瘤胃发酵的机制各不相同（Yanza等人，2021；Luan等人，2023；Yang等人，2024）。例如，C12:0比C14:0更有效地抑制瘤胃中的产甲烷菌和原生动物（Dohme等人，2001；Yanza等人，2021）。对于PUFA，研究表明顺式异构体比反式异构体更有效（Demeyer和Henderickx，1967）。目前的研究仍需进一步探讨脂肪酸与其他因素（如日粮组成、动物反应、实验条件和瘤胃发酵参数）的共同影响。尽管de Ondarza等人的元分析较为深入，但本研究通过纳入瘤胃发酵特征等额外因素，提供了更全面的视角。此外，先前研究表明，当日粮中粗饲料与精饲料的比例较高（淀粉含量高，纤维含量低）时，脂肪补充对甲烷排放的减排效果更显著（Patra等人，2013；Zhou等人，2015；Beauchemin等人，2022）。目前尚不清楚具体是哪些脂肪酸起了主导作用。因此，本研究旨在：1）利用元回归分析量化CH4排放与RAFA之间的关系；2）评估加入其他解释变量是否能比单独考虑RAFA更好地解释CH4排放的变化；3）探讨RAFA与日粮中淀粉和纤维的潜在交互作用。我们假设RAFA与肠道甲烷产生量（g/d）、产量（g/kg DMI）和强度（g/kg ECM）之间存在负相关线性关系，并认为结合其他变量能更全面解释CH4排放的变化（例如通过影响摄入量和消化率）。例如，预期RAFA与日粮中的纤维和淀粉之间存在交互作用。由于本研究仅针对哺乳期奶牛，结果主要适用于这一生理阶段，其他动物种类（牛、奶羊、山羊）可能表现出不同的反应模式。

**材料与方法**
**文献检索**
本元分析使用的数据库通过系统在线搜索包含脂肪补充对哺乳期奶牛肠道甲烷排放影响的同行评审文章建立。搜索工具包括CABI（https://www.cabidigitallibrary.org）、Web of Science（https://www.webofscience.com/）、EBSCO（https://www.ebsco.com/）、Scopus（https://www.scopus.com/）和Google Scholar（https://scholar.google.com/）。检索词为“cattle”或“cow”与“methane”和“fat”或“lipid”的组合。符合以下标准的文献被纳入数据库：1）用英语撰写并发表在同行评审期刊上的原创研究文章（非文献综述、元分析或摘要论文）；2）在哺乳期奶牛中进行的体内研究，日粮中添加脂肪以减少肠道甲烷排放；3）使用已知标准化和验证的方法（如呼吸室、GreenFeed系统、头部箱室、六氟化硫示踪剂）测量肠道甲烷排放，而非通过数学建模或代理指标估算；4）脂肪通过日粮添加，而非通过瘤胃导管，以利于动物自然接受；5）包含不含脂肪处理的对照日粮。

共检索到1775条记录，去除重复项后，筛选标题和摘要以排除综述和非牛类研究。最终选取84篇文章进行全文评估。在纳入元分析的48篇文献中，有2篇包含多个实验，共计50个实验数据。排除不符合条件的文章包括：1）评估脂肪减少CH4效果的体外实验；2）在非哺乳期奶牛（包括小母牛和肉牛）中进行的研究；3）缺乏对照组；4）脂肪与其他饲料添加剂联合使用的研究；5）在牧场进行实验且估算DMI的研究；6）未直接测量肠道甲烷排放的研究；7）通过瘤胃导管或静脉注射脂肪的研究。采用Moher等人（2009）提出的系统评价和元分析报告流程（图1）对研究进行识别、筛选和纳入。

（图1：系统评价和元分析的优先报告项目流程图，改编自Moher等人，2009。流程展示了从初始搜索到最终纳入元分析的文章筛选过程。）在纳入元分析的48篇文章中，有2篇出版物包含多个实验。数据提取和计算：从每项研究中提取数据及其各自的方差测量值（SEM），包括膳食成分和比例；膳食组成（DM、OM、NDF、ADF、CP、EE）；营养素摄入量（DM、OM、NDF和CP）；消化率变量（DM、OM、NDF和CP的消化率）；瘤胃参数（NH3-N、总VFA、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的摩尔比例以及乙酸:丙酸的比例）；动物和实验变量（包括DIM，范围为30-325）；与牛奶相关的数据（牛奶和 ECM产量、牛奶脂肪、蛋白质和乳糖产量以及牛奶脂肪、蛋白质和乳糖的百分比）；以及CH4排放量（g/d，g/kg DMI，g/kg ECM）。提取了饮食中不同形式的脂肪的信息，对于每种物理形式的脂肪，研究数量和观察次数分别为：对照组50次和65次，裂壳种子5次和13次，挤压或压碎的种子24次和48次，FA 3次和6次，油脂20次和39次，整粒种子5次和9次。在未报告ECM的研究中，使用Sjaunja等人（1990年）基于牛奶脂肪、蛋白质和乳糖含量的公式进行计算。在未报告CH4产量或CH4强度的研究中，分别使用报告的CH4和DMI以及ECM进行计算。使用误差传播方法（Roman-Garcia等人，2016年；Souza和White，2021年）估计衍生值的方差。

膳食瘤胃可用醚提取物（RAEE）计算方法是总膳食EE（% DM）减去被认为是瘤胃惰性的成分（如脂肪酸的钙盐，这些成分不影响瘤胃发酵）（Palmquist和Jenkins，2017年）。膳食RAFA的计算方法与de Ondarza等人（2024年）类似。简而言之，使用NDS Professional软件（RUM&N Sas，意大利）基于CNCPS 6.55模型（Van Amburgh等人，2015年）预测每种处理饮食中个别脂肪酸（FA，g/kg DM）的摄入量。在NDS软件中根据饲料成分及其相应的添加比例重构每种饮食的组成，并根据报告的DMI进行调整。为了确保预测的准确性，仔细选择了每种成分以反映其营养成分并实现可比的膳食组成。膳食RAFA的计算方法如下：
\[ \text{Dietary RAFA} = \frac{\text{Predicted FA intake (g/kg DM)}{\text{Dietary FAI (g/kg DM)}} \]

膳食FAI通过结合脂肪补充剂（FS；总EE中不含瘤胃惰性脂肪的比例）的FAI和基础饮食的FAI来计算，具体如下：
\[ \text{Dietary FAI} = \frac{\text{FAI\_supplement}}{100} + \frac{\text{FAI\_basal\ diet}}{100 - \text{FS} / 100} \]
根据Esposito等人（2020年的描述，FAI\_supplement的范围是0到1：对于瘤胃惰性脂肪为0，对于整粒棉籽（低）为0.1到0.3，对于整粒或压碎的种子和豆类（中等）为0.4到0.7，对于磨碎的谷物、种子和油脂（高）为0.8到1.0）。基础饮食的FAI假设为0.9（de Ondarza等人，2024年）。

模型建立：数据分析方式类似于Souza和White（2021年）。评估了三个肠道CH4响应变量，包括每日CH4产生量（g/d）、CH4产量（g/kg DMI）和CH4强度（g/kg ECM）。首先评估了实验设计（拉丁方格设计或完全随机设计）是否系统性地影响了报告的SEM。尽管SEM是一个受样本大小和残差方差影响的衍生统计量，但实验结构的差异（例如，拉丁方格设计中的重复测量和分组与完全随机设计中的独立实验单元）可能导致残差方差估计和有效样本大小的系统差异。因此，进行了ANOVA测试以确定实验设计之间的SEM是否有差异。在实验设计显著影响SEM的情况下，分别为每种设计类型计算了平均SEM。然后通过将每个SEM除以其所在设计类别的平均SEM来标准化各个SEM值。此过程旨在消除与设计相关的系统缩放效应，同时保持同一设计结构内研究之间的相对变异性。这样得到的权重反映了相对于同一设计内其他研究的精确度，而不是允许设计之间的系统SEM差异来确定研究影响。因此，研究权重代表设计类型内的相对精确度，而不是绝对的跨设计精确度。为了避免过权重衡，小于0.5 ×总体观察平均值SE值被截断到该阈值。总共有14个、12个和59个观察值分别受到CH4产生量、产量和强度的影响（占数据集的7.8%、6.7%和32.7%）。最终用于元回归分析的研究权重是根据Roman-Garcia等人（2016年）描述的调整后的SEM的倒数计算得出的，并在后续模型中使用。

建模方法首先使用lme4包v1.1–14中的lmer函数拟合线性和二次混合效应回归模型，评估肠道CH4排放量与总膳食RAFA之间的关系（R版本4.4.1，R Core Team，2023年）。总膳食RAFA被中心化到其平均值，并包括中心化值的平方项以评估非线性（二次）关联。将单个研究视为随机截距以解释研究间的变异性。线性模型仅包括中心化的膳食RAFA项，而二次模型包括线性和二次项，具体如下：
\[ \text{线性模型：} Y = \beta_0 + \text{Study} + \beta_1 \times \text{RAFA} (g/kg DM) + \text{error}, \]
\[ \text{二次模型：} Y = \beta_0 + \text{Study} + \beta_1 \times \text{RAFA} (g/kg DM) + \beta_2 \times \text{RAFA}^2 (g/kg DM) + \text{error}, \]
其中Y代表其中一个CH4响应变量，β0是截距，β1是描述RAFA每增加1 g/kg DM时Y变化的线性回归系数，β2是定义RAFA与Y关系曲率的二次回归系数，error是残差方差，RAFA是总膳食RAFA（以g/kg DM表示），包括C:12、C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、cis-C18:1、trans-C18:1、C18:2和C18:3等多种脂肪酸的总和。研究被视为随机效应。

同样的建模方法也被用来评估未经FA可访问性指数校正的CH4排放量与总膳食FA之间的线性和二次关联。这种方法允许比较校正后和未校正FA的模型性能。使用赤池信息量准则（Akaike Information Criterion）和一致性相关系数（concordance correlation coefficient）比较了两种模型的性能。我们没有观察到两种方法之间的模型性能差异；因此，开发了模型来评估不同物理形式的脂肪对CH4排放量的影响。通过将脂肪的物理形式（例如挤压种子、整粒种子、油脂、FA）作为固定效应，研究作为随机效应来拟合线性混合模型，以解释研究间的变异性。模型包括以对照饮食为参考类别的截距，以便解释其他物理形式的脂肪的估计系数。

除了RAFA外，还测试了每组响应变量的4组预测变量。第1组（模型1）包括来自膳食RAFA谱的个别脂肪酸。第2组（模型2）包括膳食特征（DC），如OM（% DM）、CP（% DM）、NDF（% DM）和瘤胃可用EE（% DM）。第3组（模型3）包括动物和实验变量（AEV），如DMI（kg/d）、OM消化率（OMD，%）、NDF消化率（NDFD，%）、DIM（d）和实验持续时间（d）。第4组（模型4）包括瘤胃发酵变量（RF），如VFA产量（mmol）、乙酸（%摩尔）、丙酸（%摩尔）和乙酸:丙酸的比例。并非所有来自第2至第4组的变量都在所有文章中报告，因此数据在模型间的可用性不同。每组解释变量的模型分别生成（模型1-4）以及与膳食RAFA结合（模型5 = RAFA + DC；模型6 = RAFA + AEV；模型7 = RAFA + RF；模型8 = RAFA + DC + AEV + RF），共计23个模型。此外，还构建了一个包含所有解释变量的完整模型。所有连续解释变量在初始模型建立之前都被中心化到其平均值，以便更好地解释。

使用向后消除方法（Gleason和White，2018年；Souza和White，2021年）开发了组合变量的模型。最初将1个或多个组中的所有候选变量包含在模型中。根据统计显著性水平依次从模型中移除变量，从最不显著的变量（P > 0.10）开始。一旦模型仅保留了具有显著效应的变量（P < 0.05）或显示趋势的变量（0.05 ≤ P < 0.10），则以移除的反顺序重新引入先前移除的变量并重新评估其潜在显著性。对于CH4强度模型，当包含所有变量组时，只有来自RAFA谱的变量被保留，因为没有其他变量组显示出显著效应，因此未报告结果。

还评估了个体RAFA与膳食淀粉和NDF之间的相互作用，因为先前的研究表明膳食脂肪与这些成分之间存在交互效应（Patra，2013年；de Ondarza等人，2024年）。最初使用连续变量测试交互项。如果检测到显著交互作用，将膳食淀粉和NDF转换为分类变量以便于解释：当淀粉含量≤20% DM时归类为低，当≥20% DM时归类为高；NDF定义为当≤35% DM时为低，当>35% DM时为高。这种分类的主要原因是数据集的范围。如果P ≤ 0.05，则在模型中保留显著的交互作用。

对于具有多组变量的模型，使用方差膨胀因子（VIF）来评估解释变量之间的多重共线性（Akinwande等人，2015年）。VIF用于评估估计回归系数的方差由于预测变量间的共线性而膨胀的程度。VIF值为1表示预测变量之间没有相关性。要求变量的VIF < 10才能留在模型中，尽管如果变量参与了显著的交互项，则允许VIF在10到100之间的变量保留（Roman-Garcia等人，2016年的建议）。重要的是，VIF不是模型选择的标准，而是用来确认最终模型是否受到多重共线性的影响。在此评估过程中，没有变量显示出升高的VIF，其范围从1.00到4.82（补充表S2-S4；doi: 10.17632/jwkscbpptw.1）。通过检查与研究的标准差\[ \sigma^s \]、误差的标准差\[ \sigma^e \]及其比值\[ \frac{\sigma^s}{\sigma^e} \]来进一步评估模型质量。在\[ \sigma^s \]大于\[ \sigma^e \]的情况下，模型可能在平均意义上是可以接受的，但由于研究间的变异性较大，预计无法很好地预测新的观察值。未考虑均方根误差（RMSE）估计，因为使用了随机研究效应，这改变了混合效应框架中RMSE的解释（Boerman等人，2015年）。

使用校正后的赤池信息量准则（AICc）来评估从相同数据集开发的模型的相对质量。此外，使用Lin的一致性相关系数（CCC）来评估观测值和预测值之间的一致性，预测值已校正研究效应（Lin，1989年）。对于使用不同数据集开发的模型进行最终比较时，使用CCC和RMSE-观测标准化比率（RSR）作为主要标准。CCC的值范围从-1到1，CCC为1表示观测值和预测值之间的一致性更好（Lin，1989年），而较低的RSR值表示模型性能更好。RSR值在0.50到0.70之间被认为是良好或令人满意的（Moriasi等人，2007年）。需要注意的是，在当前研究中使用CCC和RSR是为了识别关联并解释变异性的来源，而不是预测CH4排放量。

使用蒙特卡洛交叉验证和按研究分层的分割方法评估了新观测值的模型预测性能。在这种方法中，60%的独特研究被随机选出来形成模型推导数据集，剩余的40%的研究用于模型评估。来自给定研究的所有处理均值都被保留在推导数据集或评估数据集中，以确保没有研究在两个数据集中部分出现。这个数据分割、模型拟合和模型评估的过程使用了独特的随机数重复了100次，以确保每次迭代都有不同的推导和评估集组合。这种方法防止了研究之间的数据泄露，并能够对模型在不同数据子集中的泛化能力和预测稳定性进行稳健评估。

**结果与讨论**
当前研究中的元回归结合了来自多个实验的发现，定量总结和评估了单独的RAFA（可利用的 rumen 酸）的影响，同时考虑了饮食、动物和 rumen 因素在解释奶牛肠道 CH4 排放变化中的作用。

**数据描述**
元分析中包含的数据的描述性统计信息在表1中呈现，研究特征在补充表S1（doi: 10.17632/jwkscbpptw.1）中显示。在本研究中，饮食主要是（90%）北美和欧洲的典型喂养实践，而剩余的10%来自南美（智利和巴西）和澳大利亚。脂肪主要是通过替换某些成分作为精料的一部分来补充的，饲料来源主要是草、玉米青贮和干草。使用交叉设计和拉丁方设计进行的动物实验占数据集中研究的79%，而随机完全区组设计占21%。数据集中研究的总补充时间从11天到280天不等，大多数研究（86%）持续11到35天。超过35天的研究占数据集的14%。Harper等人（2019年）和Silveira等人（2019年）进行了4个月的试验，而其他研究（Johnson等人，2002年；Grainger等人，2010年；Martin等人，2011年；Alstrup等人，2015年；Coppa等人，2021年）进行了长达6个月或整个泌乳期的实验（补充表S1；doi: 10.17632/jwkscbpptw.1）。

**表1. 响应变量和解释变量的摘要统计**
| 变量 | n | 均值 | 标准差 | 最小值 | 最大值 |
|------------------|-------|--------|--------|--------|--------|
| CH4产生，g/d | 180 | 389 | 82.0 | 149 | 637 |
| CH4产量，g/kg DMI | 180 | 19.5 | 3.98 | 10.1 | 6.3 |
| CH4强度，g/kg ECM | 165 | 14.0 | 4.4 | 24.3 | 29.2 |
| 可利用的 rumen 脂肪酸 | | 0.51 | 17.60 | 0.025 | 11.5 |
| C12:0，g/kg DM | 180 | 0.75 | 5.4 | 0.050 | 42.2 |
| C16:0，g/kg DM | 180 | 4.2 | 11.9 | 1.4 | 17.6 |
| C16:1，g/kg DM | 180 | 0.13 | 0.069 | 0.007 | 0.595 |
| C18:0，g/kg DM | 180 | 0.97 | 0.77 | 0.198 | 5.39 |
| 反式-C18:1，g/kg DM | 180 | 0.17 | 0.39 | 0.000 | 2.16 |
| 顺式-C18:1，g/kg DM | 180 | 0.81 | 0.60 | 0.206 | 28.3 |
| C18:2，g/kg DM | 180 | 10.6 | 4.8 | 12.9 | 13.0 |
| C18:3，g/kg DM | 180 | 5.7 | 6.4 | 3.0 | 83.0 |

**饮食特征**
OM（有机物含量），%：144 ；DM（干物质）：92.7；CP（粗蛋白），%：176；NDF（不可消化纤维），%：35.0；淀粉，%：139；EE（可利用能量），%：4.7；DMI（每日代谢量），kg/d：180.1；OMD（有机物质消化率），%：86.9；NDFD（不可消化纤维消化率），%：35.0；DM中的脂肪，%：14.4。

**动物和实验变量**
DMI（每日代谢量），kg/d：180；OMD（有机物消化率），%：103.7；NDFD（不可消化纤维消化率），%：15.4；DIM（消化干物质），d：180.1；实验天数，d：180.2；总VFA（挥发性脂肪酸），mM：781；乙酸摩尔百分比：84.6；丙酸摩尔百分比：84.2；丁酸摩尔百分比：84.1；A:P比例：76.3。

**当前元回归的目标**
当前元回归的目标是确定单独或与其他因素结合的饮食RAFA如何影响泌乳奶牛的CH4排放。因此，生成了混合效应模型来解释可能提高模型性能的变量，以解释CH4排放的变化，并捕捉与饮食RAFA的潜在交互作用。在解释解释变量的效果时，应注意模型中的斜率估计表示在保持所有其他解释变量不变的情况下，每个连续解释变量变化一个单位时CH4排放的预期变化。模型的参数估计以及拟合统计信息可以在表4至7中找到。交叉验证结果在补充表S2至S4中呈现（doi: 10.17632/jwkscbpptw.1）。

**结论**
本研究表明，饮食中的RAFA对奶牛的CH4排放有显著影响。通过结合多项实验数据，可以更全面地理解和评估RAFA的作用。为了支持这一发现，Martin等人（2008年）发现，喂食亚麻籽油（64%）的奶牛比喂食挤压亚麻籽（38%）或 crude 亚麻籽（12%）的奶牛对CH4排放的抑制效果更明显，尽管这三种饲料的脂肪含量相似。我们关于RAFA的研究结果支持了先前的报告，即为了提高脂肪调节CH4排放的效果，可能需要对脂肪来源进行某种程度的预处理。表2. 不同脂肪酸饮食之间的模型比较，包括是否校正了可利用性指数。

在支持这一发现的基础上，Martin等人（2008年）发现，与喂食挤压亚麻籽或 crude 亚麻籽相比，喂食亚麻籽油的奶牛对CH4排放的抑制效果更强（分别为64% vs 38% 和 12%），尽管所有补充脂肪的饮食中的脂肪酸含量相似。我们的研究结果也表明，为了提高脂肪酸在调节CH4排放方面的效果，可能需要对脂肪来源进行一定程度的预处理。表2展示了不同脂肪酸饮食模型之间的比较，包括是否考虑了可利用性指数（accessibility index）的校正。

表3. 不同脂肪物理形态对CH4排放影响的斜率比较

在单组模型中，使用单独的日粮脂肪酸（RAFA）的模型1在解释CH4排放变化方面表现较差（可利用性系数CCC = 0.126，残差标准偏差RRS = 0.907）。尽管拟合度不高，但该模型仍保留了一些与CH4排放减少相关的脂肪酸，包括C12:0（-12.1克/天，P < 0.001）、C14:0（-4.02克/天，P < 0.001）、C16:0（-5.25克/天，P < 0.001）和C18:3（-3.54克/天，P < 0.001）。这与之前的元分析结果一致，表明中链脂肪酸（MCFA）和不饱和脂肪酸（PUFA）可以有效减少CH4排放（Patra, 2013; de Ondarza等人, 2024）。不过，在Hristov等人（2011）的一项研究中，当奶牛被补充C12:0、C14:0和C18:0时，并未发现CH4排放的差异。在Hristov等人的研究中，C18:0被用作对照组，假设其CH4抑制效果最小，但我们的研究结果表明，在C18:0的添加水平（约9克/千克干物质DMI）下，CH4已经有所减少，这可能会掩盖C12:0和C14:0的潜在效果。模型3（AEV）的拟合度更好（可利用性系数CCC = 0.640，残差标准偏差RRS = 0.644），表明干物质DMI（DMI）（20.6克/天，P < 0.001）和NDF消化率（3.36克/天，P < 0.001）在解释CH4排放变化中起着重要作用。Niu等人（2018）的研究也指出DMI是CH4排放的主要决定因素。因此，在脂肪补充的情况下，由于DMI通常会减少（de Ondarza等人, 2024; Giagnoni等人, 2025），伴随的CH4排放减少可能是由于饲料摄入量减少的间接效应。基于RF变量的模型4显示了中等的预测能力（可利用性系数CCC = 0.398，残差标准偏差RSR = 0.660），其中乙酸和丁酸的摩尔比例是解释CH4排放变化的重要变量（分别为13.7克/天，P < 0.001和12.8克/天，P < 0.001），这可以通过它们在瘤胃中支持甲烷生成的作用来解释（Ungerfeld, 2020）。

将日粮RAFA与其他变量组合使用（除了DC外）比单独使用日粮RAFA的模型在预测CH4排放方面有显著的改进（表4）。包括AEV（模型6）的模型拟合度更好（可利用性系数CCC = 0.544，残差标准偏差RRS = 0.700），而将日粮RAFA与DC组合使用（模型5）的模型拟合度并未改善（可利用性系数CCC = 0.090 vs 0.126，残差标准偏差RSR = 0.928 vs 0.907）。这表明，在模型中已经考虑了日粮RAFA的情况下，添加日粮淀粉和瘤胃可用脂肪可能不会增加预测价值。de Ondarza等人（2024）的研究也表明，淀粉对CH4排放没有显著影响。将DC、AEV和RF（模型8）与日粮RAFA一起使用，获得了最佳模型拟合度（可利用性系数CCC = 0.509；AICc = 469.9，残差标准偏差RRS = 0.558），该模型保留了解释CH4排放变化的关键因素，包括C14:0、C16:0、C18:3、DMI、NDF消化率、总VFA和乙酸。这种多种因素之间的关系是合理的，因为脂肪补充对CH4排放的影响可能是直接的，通过C14:0调节甲烷生成菌和原生动物种群，或者间接的，通过减少饲料摄入量和纤维消化率来实现。我们还观察到日粮RAFA与饮食中的淀粉和NDF含量之间的相互作用（P < 0.001，表7）。日粮中淀粉含量超过20% DM时，C14:0（-35.6克/天，P < 0.001）、C16:0（-33.2克/天，P < 0.001）和C18:0（-55.3克/天，P < 0.001）对CH4排放的抑制作用增强。我们的研究还发现，日粮RAFA，尤其是C12:0和C14:0与饮食中的NDF含量之间的相互作用可以调节CH4排放。当饮食中的NDF含量≤35% DM时，这些脂肪酸具有更大的潜力降低CH4排放，估计值分别为C12:0和C14:0的-14.5克/天（P < 0.001和-39.1克/天（P < 0.001）。Bayat等人（2017）报告称，在以低粗饲料与精饲料比例（35:65）喂养的泌乳奶牛中，添加葵花籽油（总脂肪酸含量65.1克/千克DM）更能有效减少CH4排放。Pirondini等人（2015）的一项单一响应试验也发现，当奶牛在高淀粉饮食（淀粉含量27.7% DM，NDF含量31% DM）中补充鱼油时，CH4排放会降低。我们的关于RAFA的研究结果支持了先前的报告，即需要平衡日粮中的淀粉和纤维含量以优化脂肪补充在减少CH4排放方面的效果，这需要进一步研究。

在单组模型中，使用单独的日粮RAFA的模型1在解释CH4产量变化方面的表现最差（可利用性系数CCC = 0.082，残差标准偏差RRS = 0.939）。模型1识别出一些与CH4产量负相关的脂肪酸，包括C12:0、C16:0、顺式-C18:1、C18:2和C18:3。在RF变量中，总VFA（0.099克/千克DM，P < 0.001）和丙酸的摩尔比例（-0.699克/千克DM，P < 0.001）是唯一显著的变量，这支持了丙酸作为氢储存库在CH4排放中的作用（Ungerfeld, 2020）。包括AEV的模型（模型3）显示了NDF消化率的重要性，尽管拟合度适中（可利用性系数CCC = 0.150，残差标准偏差RRS = 0.797，表5）。Martin等人（2008）也报告称，在分别添加4.2%、4.4%和5.8% DM的 crude 亚麻籽、挤压亚麻籽和亚麻籽油的奶牛中，CH4产量和NDF消化率都降低了。

在当前的研究中，我们还检测到日粮RAFA与RF变量之间的显著交互作用（表7），这些交互作用仅在淀粉含量超过饮食DM的20%时明显。日粮中的淀粉水平越高，C14:0（-35.6克/天，P < 0.001）、C16:0（-33.2克/天，P < 0.001）和C18:0（-55.3克/天，P < 0.001）对CH4排放的抑制作用越强。我们的研究还发现，日粮RAFA，特别是C12:0和C14:0与饮食中的NDF含量之间的相互作用可以调节CH4排放。只有当饮食中的NDF含量≤35% DM时，这些脂肪酸才具有更大的降低CH4排放的潜力，估计值分别为C12:0的-14.5克/天（P < 0.001）和C14:0的-39.1克/天（P < 0.001）。Bayat等人（2017）报告称，在以低粗饲料与精饲料比例（35:65）喂养的泌乳奶牛中，添加葵花籽油（总脂肪酸含量65.1克/千克DM）更能有效减少CH4排放。Pirondini等人（2015）的单一响应试验也发现，在高淀粉饮食（淀粉含量27.7% DM，NDF含量31% DM）中补充鱼油时，CH4排放降低。我们的关于RAFA的研究结果支持了先前的报告，即需要平衡日粮中的淀粉和纤维含量以优化脂肪补充在减少CH4排放方面的效果。

在不同模型组中，使用单独的日粮RAFA的模型1的拟合度最弱（可利用性系数CCC = 0.082，残差标准偏差RRS = 0.939）。模型1识别出一些与CH4产量负相关的脂肪酸，包括C12:0、C16:0、顺式-C18:1、C18:2和C18:3。在RF变量中，总VFA（0.099克/千克DM，P < 0.001）和丙酸的摩尔比例（-0.699克/千克DM，P < 0.001）是唯一显著的变量，这支持了丙酸作为氢储存库在CH4排放中的作用（Ungerfeld, 2020）。包括AEV的模型（模型3）显示了NDF消化率的重要性，尽管拟合度适中（可利用性系数CCC = 0.150，残差标准偏差RRS = 0.797，表5）。Martin等人（2008）报告称，在分别添加4.2%、4.4%和5.8% DM的 crude 亚麻籽、挤压亚麻籽和亚麻籽油的奶牛中，CH4产量和NDF消化率都降低了。

模型7将RAFA和RF变量结合使用，提供了最佳的拟合度（可利用性系数CCC = 0.425，残差标准偏差RRS = 0.654，表5）。该模型保留了C16:0、C18:3和总VFA以及丙酸的摩尔比例作为影响CH4产量的显著变量。将日粮RAFA与AEV结合使用的模型（模型6）的拟合度也较为适中（可利用性系数CCC = 0.356，残差标准偏差RRS = 0.844），而包括DC的模型（模型5）的拟合度更低（可利用性系数CCC = 0.136，残差标准偏差RRS = 0.980）。有趣的是，包括所有其他变量（模型8）并未改善模型性能，这表明可能有其他因素（如瘤胃微生物组）可以解释CH4产量的变化。RF变量的重要性突显了它们的生物学相关性，因为日粮RAFA可以直接影响驱动甲烷生成的瘤胃发酵途径。例如，中链脂肪酸如C16:0可以抑制瘤胃甲烷生成菌，而不饱和脂肪酸如C18:3则通过生物氢化作用作为氢储存库，从而增加丙酸和总VFA的产生，导致瘤胃发酵动态的变化（Patra, 2013; Beauchemin等人, 2020; Yang等人, 2024）。

在当前的研究中，我们还检测到C14:0（-0.891克/千克DMI，P = 0.002，表7）与日粮中的淀粉之间的显著交互作用，这种交互作用仅在淀粉含量超过饮食DM的20%时明显。同样，C14:0和C16:0与饮食中的NDF之间也存在交互作用。具体来说，当NDF含量≤35% DM时，C14:0的CH4抑制作用更为显著（估计值-0.763克/千米；P < 0.001），而在NDF含量较高的饮食中，C16:0的CH4抑制作用更强（估计值-0.972克/千米；P < 0.001）。然而，尽管某些脂肪酸与淀粉和/或NDF之间存在强烈的交互作用，但整体模型性能仍较弱，因此应对结果持谨慎态度。这些效应也可能受到未在当前分析中考虑的其他变量的影响。

在评估的模型组中，使用日粮RAFA的模型（模型1）的表现较为一般（可利用性系数CCC = 0.088，残差标准偏差RSR = 0.949），而使用RF变量的模型（模型4）表现更好（可利用性系数CCC = 0.419，残差标准偏差RSR = 0.655，表5）。模型1识别出一些与CH4产量负相关的脂肪酸，包括C12:0、C16:0、顺式-C18:1、C18:2和C18:3。在RF变量中，总VFA（0.099克/千克DM，P < 0.001）和丙酸的摩尔比例（-0.699克/千克DM，P < 0.001）是唯一显著的变量，这支持了丙酸作为氢储存库在CH4排放中的作用（Ungerfeld, 2020）。模型3包括AEV，显示了NDF消化率的重要性，尽管拟合度适中（可利用性系数CCC = 0.150，残差标准偏差RRS = 0.797，表5）。Martin等人（2008）也报告称，在分别添加4.2%、4.4%和5.8% DM的 crude 亚麻籽、挤压亚麻籽和亚麻籽油的奶牛中，CH4产量和NDF消化率都降低了。在甲烷强度（CH4，g/kg ECM）模型中，使用来自日粮的 rumen 可利用脂肪酸（RAFA）、日粮特性（DC）、动物和实验变量（AEV）以及 rumen 发酵（RF）数据集单独或联合估计参数（P 值在括号中给出）：

| 项目 | RAFA | ADC | AEV | RF | RAFA + DC | RAFA + AEV | RAFA + RF |
|--------------|-------------|--------------|--------------|-------------|-------------|-------------|
| 截距 | 14.2 (<0.001) | 14.1 (<0.001) | 12.9 (<0.001) | 15.0 (<0.001) | 14.1 (<0.001) | 13.1 (<0.001) |
| C12:0, g/kg DM | -0.187 (0.043) | -0.085 (0.062) | -0.089 (0.080) | 4.20 (0.029) | 3.57 (0.053) | 6.63 (0.003) |
| C14:0, g/kg DM | -0.085 (0.062) | -0.089 (0.080) | 3.57 (0.053) | -1.34 (<0.001) | -1.18 (<0.001) | -1.53 (<0.001) |
| C16:1, g/kg DM | 4.20 (0.029) | 3.57 (0.053) | -1.18 (<0.001) | -1.67 (<0.001) | -0.086 (<0.001) | -0.109 (<0.001) |
| C18:0, g/kg DM | -1.34 (<0.001) | -1.18 (<0.001) | -1.53 (<0.001) | -1.67 (<0.001) | -0.052 (<0.047) | -0.049 (0.090) |
| NDF, % DM | 0.159 (0.001) | 0.139 (0.003) | -0.638 (<0.001) | 0.119 (0.003) | 0.059 (0.037) |
| Rumen available EE, % DM | -0.638 (<0.001) | -0.404 (<0.001) | 0.159 (0.001) | 0.119 (0.003) | 0.059 (0.037) |
| Total VFA, mM | 0.102 (0.003) | 0.050 (0.071) | -0.469 (<0.001) | -0.229 (0.031) | -0.469 (<0.001) |
| Propionate, % molar | -0.469 (<0.001) | -0.229 (0.031) | -0.469 (<0.001) | -0.229 (0.031) | -0.229 (0.031) |

**模型比较：**
- 模型 1: 仅有 RAFA
- 模型 2: RAFA + ADC
- 模型 3: RAFA + AEV
- 模型 4: RAFA + RF
- 模型 5: RAFA + DC
- 模型 6: RAFA + AEV
- 模型 7: RAFA + RF + DC + AEV
- 模型 8: RAFA + RF + DC + AEV + RF
- 模型 9: RAFA + RF + DC + AEV + RF + NDF
- 模型 10: RAFA + RF + DC + AEV + NDF +膳食淀粉
- 模型 11: RAFA + RF + DC + AEV + NDF +膳食淀粉 + C14:0
- 模型 12: RAFA + RF + DC + AEV + NDF + C16:0
- 模型 13: RAFA + RF + DC + AEV + NDF + C16:1
- 模型 14: RAFA + RF + DC + AEV + NDF + C18:0
- 模型 15: RAFA + RF + DC + AEV + NDF + C18:1
- 模型 16: RAFA + RF + DC + AEV + NDF + C18:3
- 模型 17: RAFA + RF + DC + AEV + NDF + C18:3 +膳食淀粉 + C16:1
- 模型 18: RAFA + RF + DC + AEV + NDF + C18:0 + C16:0 + C18:1
- 模型 19: RAFA + RF + DC + AEV + NDF + C18:0 + C16:1 + C18:3

**AIC 值（越低越好）：**
模型 1: 7.33
模型 2: 3.27
模型 3: 3.48
模型 4: 7.12
模型 5: 3.67
模型 6: 29.73
模型 7: 3.03
模型 8: 0.08
模型 9: 0.09
模型 10: 0.17
模型 11: 0.14
模型 12: 0.14
模型 13: 0.19
模型 14: 0.14
模型 15: 0.94
模型 16: 0.92
模型 17: 0.83
模型 18: 0.76
模型 19: 0.90

**模型拟合度：**
组合 RAFA 与动物和实验数据以及其他数据的模型（模型 2-19）没有显著差异，仅脂肪酸变量具有显著性。

**模型选择：**
在校正的 Akaike 信息准则（AICc）和均方根误差标准化比率（RRS）方面，模型 7（RAFA + RF）的拟合度最高（CCC = 0.195，RSR = 0.826，表 6）。添加日粮特性（模型 5）和动物和实验变量（模型 6）也改善了模型拟合度，尽管程度较小（CCC = 0.147 和 0.144，RRS = 0.909 和 0.913）。在不同模型中始终显著的变量包括 C18:0、NDF 和 rumen 可利用能量（EE）、NDF 消化率、总 VFA 以及丙酸的摩尔比例。

**脂肪补充对 CH4 排放的影响：**
关于通过补充脂肪来减少 CH4 排放的研究很少发现牛奶产量的增加。最近的一项荟萃分析报告称，脂肪补充降低了牛奶脂肪百分比、牛奶脂肪产量和牛奶粗蛋白百分比（de Ondarza 等，2024）。然而，脂肪添加导致 CH4 强度变化的原因是 CH4 产生量的变化还是哺乳性能的变化尚不清楚，这超出了本研究的范围。

**交互效应：**
观察到 C14:0 与日粮淀粉之间存在显著交互作用，其中 C14:0 的 CH4 抑制效应（-0.778 g/kg DMI，P = 0.008，表 7）仅在淀粉含量超过 20% DM 时显著。此外，还检测到 C14:0 与 C16:0 与日粮 NDF 含量的交互作用。具体来说，在低 NDF （<35% DM）的日粮中，C14:0 有显著的负相关作用（估计值 -0.800 g/kg DMI；P = 0.005），而在高 NDF 的日粮中，C16:0 的抗甲烷生成效应更明显（估计值 -0.680 g/kg DMI，P < 0.001）。尽管观察到某些脂肪酸与淀粉和/或 NDF 之间的交互作用，但交互项的总体模型性能仍然较弱，这些发现应谨慎解释。

**研究局限性：**
尽管尽力构建综合模型以解释脂肪补充对 CH4 排放的生理影响，但本研究存在一些局限性。当前研究中使用的 CCC 和 RSR 主要用于比较模型，而不是作为评估预测准确性的绝对指标。CCC 值相对较低的模型主要用于解释性推断，而不是预测 CH4 排放。虽然补充材料中提供了交叉验证结果，但它们仅提供了有限的模型性能指标，不应被视为预测应用的验证。我们没有考虑模型中多个变量集的非线性关系，需要进一步实验来探索本研究中未考虑的交互作用，例如通过包含 rumen 微生物组数据（Yang 等，2024）。

**结论：**
在本研究中，我们证明总日粮 RAFA 每增加 10 g/kg，CH4 产量（g/d）、产量（g/kg DMI）和强度（g/kg ECM）分别降低了 26%、0.92% 和 0.90%。观察到个别脂肪酸（如 C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1 和 C18:2）与 CH4 排放之间存在二次关系，即超过一定添加水平后效果减弱，而其他脂肪酸（如 C12:0 和 C18:3）在数据集的整个剂量范围内保持一致的减少效果。在评估不同变量集时，仅靠 RAFA 无法解释 CH4 排放的变化；通过包含日粮、动物和 rumen 因素（主要是日粮淀粉和 EE、DMI、表观 NDF 消化率、总 VFA 以及乙酸、丙酸和丁酸的摩尔比例）可以提高模型拟合度。此外，日粮中的淀粉和 NDF 含量与脂肪酸之间存在交互作用，其中 C12:0、C14:0 和 C16:0 在淀粉 > 20% DM 和 NDF ≤ 35% DM 的日粮中对 CH4 排放的抑制作用更大。我们的结果强调了在配制日粮时平衡淀粉和纤维含量（即粗饲料与精饲料的比例）以有效减少 CH4 的重要性。然而，平衡淀粉和纤维含量以减少 CH4 还需考虑消化潜力、哺乳性能以及对 rumen 微生物的影响，这些超出了本研究的范围，需要进一步研究。