建立了一种针对EHP、VpTPD和VpAHPND的三重TaqMan qPCR检测方法，并通过使用甲基纤维素优化了该方法的效果

《Journal of Invertebrate Pathology》：Establishment of A triplex TaqMan qPCR assay for EHP, VpTPD, VpAHPND with optimized efficacy using methyl cellulose

三联TaqMan荧光定量PCR方法用于同时检测南美白对虾的肝胰微孢子虫、副溶血性弧菌TPD型和AHPND型病原，评估多重靶标干扰效应及大分子添加剂（如甲基纤维素）对扩增效率的影响，建立高特异性、灵敏度达101拷贝/μL的可靠诊断技术。

　　

王玉芝|崔创|唐晓倩|邢静|盛秀珍|池恒|詹文斌

中国海洋大学水产动物病理学与免疫学实验室，青岛266003

摘要

Vannamei对虾中新兴病原体混合感染的频繁发生对可持续水产养殖构成了严重威胁。因此，迫切需要开发高效的多重检测技术，以便更快、更准确地识别主要致病因子。本文开发了一种三重TaqMan荧光定量PCR检测方法，用于同时检测Ecytonucleospora hepatopenaei（EHP）、V_pTPD和V_pAHPND。基于该方法，系统评估了多个目标之间的干扰以及四种常见大分子添加剂对目标序列扩增效率的影响。结果表明该方法具有高特异性，无交叉反应，重复性优异，每种病原体的检测限为10^1拷贝/μL。目标间干扰分析显示，随着共扩增竞争目标的浓度增加，目标模板的Ct值最初下降随后反弹。值得注意的是，在目标浓度较高时，这种干扰显著减弱。在高目标浓度下，这种干扰可以忽略不计，但在接近定量限时能提高扩增效率，从而有助于可靠地定性分析低丰度病原体。此外，甲基纤维素显著提高了扩增效率，有效缩短了检测时间，使过程更加快速便捷，表明其作为优化多重PCR检测系统的有希望的添加剂具有潜力。本研究为EHP、V_pTPD和V_pAHPND的快速检测奠定了坚实的基础，为水产养殖中多重TaqMan荧光定量PCR检测技术的发展提供了宝贵的方法学见解。

引言

全球虾类养殖中日益增加的经济损失越来越多地归因于新兴疾病，尤其是肝胰腺微孢子虫病（HPM）、急性肝胰腺坏死病（AHPND）和透明后期幼虫病（TPD）（Govindasamy等，2023；Lee等，2022；Yu等，2022）。Ecytonucleospora hepatopenaei（EHP）是一种严格的细胞内寄生虫，是Ecytonucleospora属的新成员（Wang等，2023）。EHP主要寄生于虾的肝胰腺细胞或肠上皮细胞（Tourtip等，2009）。尽管HPM的死亡率相对较低，但该病原体会导致虾生长迟缓或矮小，从而造成重大经济损失（Hou等，2021；Jaroenlak等，2025；Piamsomboon等，2019；Tang等，2015）。AHPND是一种由携带PirA/B毒素质粒的Vibrio parahaemolyticus（V_pAHPND）菌株引起的致命弧菌病，可导致严重的肝胰腺病变和高达100%的死亡率（Gunasekara等，2025；Han等，2015；Yan等，2025）。最新研究表明，PirA和PirB质粒有可能横向传播到其他Vibrio物种，如V. campbellii和V. owensii（Dong等，2017；Kondo等，2015；Liu等，2015）。这种跨物种传播使得AHPND的准确检测变得复杂，并对疾病预防和控制策略构成重大挑战。TPD的主要致病因子是一种致命的V. parahaemolyticus菌株（V_pTPD），能够产生高毒性的VHVP-1和VHVP-2蛋白。V_pTPD主要影响后期幼虫，使虾体呈现透明或玻璃状（Jia等，2024；Yang等，2022；Zou等，2020）。更令人担忧的是，HPM与AHPND经常同时发生（Aranguren等，2017；Janakiram等，2018；Zhu等，2022），也有报道指出V_pAHPND与病毒共感染（Han等，2019），这表明复杂的共感染正在日益阻碍有效的虾病控制。仅依赖单一病原体诊断可能导致对流行病学状况的评估不准确。因此，迫切需要灵敏的多重诊断方法来同时监测关键病原体，为虾类养殖中的疾病控制提供可靠的科学框架。

已经开发了多种先进的水生病原体诊断技术，如TaqMan荧光定量PCR（TaqMan qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫层析测定（ICA）（Arulmoorthy等，2020；Ganjoor，2015；G?kda?和?a?atay，2024；Ibarra-Gámez等，2023；Khorosheltseva等，2022；Lee等，2022；Sumon等，2024）。其中，TaqMan qPCR以其高特异性和灵敏度而著称（Bar等，2012；Tellinghuisen和Spiess，2019；Guo等，2025）。大量的单目标TaqMan qPCR检测方法已显示出显著的临床灵敏度和有效性，使其成为水产养殖中疾病诊断的可靠工具（Andrade等，2007；Gong等，2021；Guo等，2025；Li等，2018；Matejusova等，2008；Pooljun等，2016；Wu等，2019）。例如，有人使用EHP的β-tubulin基因开发了TaqMan qPCR检测方法（Piamsomboon等，2019），还有研究开发了针对V_pAHPND的PirA和PirB基因的双重TaqMan qPCR检测方法（Cruz-Flores等，2019）。TaqMan qPCR可以通过使用标记不同荧光基团的探针在单次反应中分析多个目标基因，从而实现多重检测（Ayala等，2025；Cowley等，2019；Yamkasem等，2022）。据报道，还开发了一种四重TaqMan qPCR检测方法，用于同时检测四种产生毒素的藻类（Eckford-Soper和Daugbjerg，2015）。目前，关于在水生病原体检测中应用多重TaqMan qPCR的研究仍然有限。此外，影响关键检测结果（Ct值）的复杂因素尚未得到充分阐明（Bar等，2012；Bustin等，2025；Ruiz-Villalba等，2021；Tellinghuisen和Spiess，2019）。特别是在目标浓度不同时，多重扩增过程中的目标间干扰的系统研究明显不足（K?ppel等，2021；Te等，2015）。因此，开发和优化用于水生病原体的多重TaqMan qPCR方法具有重大潜力。

为了提高虾养殖中EHP、V_pTPD和V_pAHPND的有效检测能力，并推进多重诊断技术，本研究开发并验证了一种针对这些关键病原体的三重TaqMan qPCR检测方法。同时，我们系统研究了多重系统中的目标间干扰以及分子拥挤剂对扩增效率的影响。除了建立一个新的检测平台外，我们的目标还包括为评估水产养殖中诊断结果的可靠性提供可靠的方法学框架。

部分摘录

引物-探针设计及质粒构建

根据现有报告和现行标准，从公共GenBank数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中选取了EHP基因组的β-tubulin基因、V_pTPD的tcdB毒力基因序列以及V_pAHPND的pirA基因序列作为这三种病原体的特异性检测基因。使用NCBI-BLAST工具和DNAMAN软件（Lynnon Biosoft）鉴定了这三种病原体的保守序列（表S1）。

TaqMan qPCR检测方法的建立与优化

详细建立了单重和三重qPCR检测的最佳条件，包括特定的引物和探针浓度以及退火温度。这些优化参数的详细信息以及最终的热循环程序见表3。

数字PCR散点图的原始数据显示，阳性样本和阴性样本之间的荧光值存在显著差异，表明所建立的方法具有优势

讨论

影响Vannamei对虾的新兴疾病不断增多，需要新的多重检测方法（Mai等，2025；Chen等，2022）。已经存在针对EHP和V_pAHPND的单TaqMan qPCR检测方法，而SYBR Green qPCR和传统PCR可用于V_pTPD（Gunasekara等，2025；Han等，2015；Hou等，2021；Jia等，2026；Liu等，2018；Liu等，2023；Liu等，2023；Yang等，2022）。然而，在同时检测这些病原体方面仍存在技术差距

结论

本研究首次建立了针对EHP、V_pTPD和V_pAHPND的三重TaqMan荧光定量PCR检测方法，表现出优异的特异性、出色的重复性和合理的灵敏度。同时，研究发现多目标干扰会生物物理地调节扩增过程，随着模板浓度的增加，其影响从促进转变为抑制。研究还探讨了大分子拥挤剂的作用，识别了甲基

数据可用性声明

由于本研究中未生成或分析任何数据集，因此不适用数据共享。

未引用参考文献

Han等（2015）。

CRediT作者贡献声明

王玉芝：撰写——原始稿件、可视化、项目管理、方法学、数据分析、数据管理。崔创：撰写——审稿与编辑、撰写——原始稿件、项目管理、资金获取。唐晓倩：撰写——审稿与编辑、资源提供、项目管理、方法学、资金获取。邢静：撰写——审稿与编辑、验证、资源提供、调查。盛秀珍：撰写——审稿与编辑。池恒：撰写——审稿与

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（项目编号：2024YFD2401200）和国家自然科学基金（资助编号：32503246）的支持。