携手共进：协同利用超临界二氧化碳与生物基离子液体提取技术，可持续地从欧洲大型海藻中分离岩藻黄质

《The Journal of Supercritical Fluids》：Better Together: Synergistic Supercritical CO2 and Biobased Ionic Liquid Extraction for Sustainable Isolation of Fucoxanthin from European Macroalgae

本研究采用生物基绿色离子液体（BIL）和超临界二氧化碳联合预处理和提取方法，显著提高紫菜中叶黄素的提取效率，比传统方法提高2.5倍以上，验证了BIL预处理对破坏细胞壁、提高叶黄素可及性的效果。

　　

马塞尔·久尔卡奇（Marcell Gyurka?）| 塔雅·日特克·马科特（Taja ?itek Makoter）| 米哈·格里尔茨（Miha Grilc）| 布拉兹·利科扎尔（Bla? Likozar）| 日尔科·克内兹（?eljko Knez）| 马莎·克内兹·马雷夫茨（Ma?a Knez Marevci）

马里博尔大学化学与化学工程学院分离过程与产品设计实验室，斯梅塔诺娃街17号，SI-2000马里博尔，斯洛文尼亚

摘要

Undaria pinnatifida是一种入侵性的棕色大型藻类，分布于欧洲沿海地区。本研究旨在通过可持续提取其药用活性生物分子来探索其利用价值。采用一种环保的组合方法（包括基于生物的离子液体cholinium-L-lysinate和超临界二氧化碳）最大化地从Wakame中回收具有健康促进作用的黄质fucoxanthin（Fx）。预处理条件保持在室温下，离子液体添加量为2%；而超临界提取器中的提取压力和温度则进行了优化。在40°C和600巴的压力下，以及在没有离子液体预处理的情况下在25°C和700巴的压力下，提取240分钟后，获得了最高的Fx产量（0.133毫克/克干藻）。相比之下，经过离子液体预处理的海藻在60°C和400巴的压力下的Fx提取产量为0.351毫克/克藻，提高了2.5倍以上，这证实了使用cholinium-L-lysinate破坏细胞壁可提高Fx产量的假设。重复实验验证了该组合方法的可重复性，变异系数为7.18%。此外，响应面方法分析进一步证实了这些发现，表明无论是否进行离子液体预处理，两种方法都能对Fx产量进行统计上显著的预测，其中离子液体辅助的模型表现出更高的可重复性和预测准确性。

引言

传统的药用植物提取方法涉及使用有害的石化产品的多步骤固液提取过程，通常需要先对植物材料进行精细机械研磨以破坏细胞结构。尽管如此，这种方法会引入显著的热机械应力，可能导致热不稳定生物活性化合物（如类胡萝卜素）的降解[1]、[2]。此外，使用有毒和有害的提取介质来分离生物活性化合物完全不符合绿色化学的12项原则[3]，这些原则提倡用更环保、更可持续的替代品取代这些溶剂。相比之下，结合使用极性离子液体（ILs）和非极性超临界二氧化碳（scCO₂）的预处理和提取方法消除了高温下强烈研磨和使用可疑石化产品的需要[4]。由于离子液体能够分解木质纤维素生物质[5]，它们可以部分溶解植物细胞壁的成分[6]，因此只需要粗略的预处理（图1）。这样，细胞内部的次级代谢物就能被浸出，并更容易被scCO₂溶解，在温和的温度下有效溶解多种非极性和低极性分析物，最终得到无溶剂的提取物。这种方法保护了对热敏感的植物化学物质，并提高了对非极性分子的选择性，优于传统的浸渍技术[4]、[7]。

由于极性离子液体在scCO₂中的溶解度很低，而scCO₂又能有效地溶解在离子液体中，因此一方面可以进行提取；另一方面，在超临界流体通过预处理过的植物材料后，提取物不会被离子液体污染[4]、[8]。为了进一步增强这种过程的可持续性，可以用地源和生物基的离子液体（BILs）替代传统的化石燃料基离子液体，因为后者会随时间形成有毒的降解产物。其中一类是氨基酸（AA）基的BILs，其阳离子或阴离子或两者都来源于氨基酸。这些更环保的离子液体完全可生物降解且具有生物相容性，这意味着所得提取物符合食品级标准，可用于营养保健品或制药行业的配方[9]、[10]。 先前的研究表明，如1-丁基-3-甲基咪唑鎓基卤化物、更可持续的1-乙基-3-甲基咪唑鎓（EMIM）基醋酸盐以及新一代的基于胆碱的氨基酸化合物等离子液体能够溶解木质纤维素的成分，特别是纤维素及其保护的细胞壁[6]、[11]、[12]。特别是2-羟基-N,N,N-三甲基乙胺鎓（S）-2,6-二氨基己酸盐（简称[Chol][Lys]）能够通过形成氨基与阴离子的羧基以及纤维素的羟基之间的氢键网络来溶解生物聚合物（如纤维素）[13]。除了纤维素外，基于胆碱的离子液体还更适用于从棕色大型藻类中溶解和提取藻酸盐（细胞壁的主要成分）[14]。这些溶解特性使我们得出结论：使用BILs对Wakame进行预处理可以通过破坏棕色海藻的顽固细胞壁来促进Fx的提取。 在这种新方法中，使用了两种互补的绿色环保溶剂，这两种溶剂均被CHEM21选择指南列为推荐溶剂[15]，从而实现了更温和、更高效且选择性更强的类胡萝卜素提取。据我们所知，这是首次报道使用BIL [Chol][Lys]（图2）对入侵性棕色大型藻类Undaria pinnatifida（商业上称为Wakame）进行预处理，这种藻类已在欧洲、南美洲和澳新地区的许多沿海地区成为外来物种[16]。 在室温下进行的BIL预处理无需进行广泛的机械研磨，部分破坏了藻类细胞壁，从而促进了后续的超临界流体提取类胡萝卜素的过程。以fucoxanthin（Fx）作为模型化合物进行了验证，Fx是一种在棕色大型藻类中含量丰富的类胡萝卜素，以其健康促进作用（包括抗肥胖、抗氧化和抗癌效果）而闻名[17]、[18]。尽管[Chol][Lys]能够破坏藻类细胞壁，从而显著提高细胞内亲脂性化合物的可用性，但纯离子液体的高粘度对质量传递构成了显著障碍，可能导致Fx被粘稠的离子液体和部分溶解的细胞壁物质膜困住。在超临界条件下，这种阻力被有效降低。scCO₂在离子液体相中的溶解降低了离子液体中阳离子和阴离子之间的分子间作用力，从而大幅降低了预处理介质的粘度[19]。这最终提高了Fx的扩散性，促进了其从受损基质快速转移到超临界溶剂相中。 未经处理的藻类与经过BIL预处理的藻类之间的比较分析显示，使用scCO₂提取Fx的产量显著提高，证实了这种可持续预处理方法的有效性。这种方法代表了环保离子液体在可持续海洋生物质利用方面的新应用，为传统提取过程提供了绿色替代方案，同时最大化了从入侵性藻类中回收高价值生物活性化合物的效率。

材料与试剂

干燥的Undaria pinnatifida（含水量：1.92% ± 0.33%），采自大西洋的加利西亚地区（西班牙），由Algamar Europe GmbH购买，并由Algas Atlánticas Algamar S.L.（西班牙Pazos de Borbén）提供。这种棕色大型藻类以片状形式运输，在使用前被切成小块。随后直接使用，无需进一步纯化，并储存在凉爽干燥的地方直至加工。

从Wakame中提取Fx的产量

本研究探讨了[Chol][Lys]预处理对从Wakame中提取Fx的影响。首先，对对照样品（纯BIL和Wakame）的分析表明，预处理过程中的Fx提取量可以忽略不计。无论生物质与BIL的比例如何，Fx的回收量始终低于检测限（补充材料中的色谱图见图S4）。具体来说，添加2% BIL的样品中Fx的产量低于0.0013毫克/克藻。

结论

在这项关于使用scCO₂从未经处理的Wakame和经过BIL预处理的Wakame中提取Fx的比较研究中，最大产量提高了160%以上，这清楚地表明BIL预处理步骤对于提高Fx产量至关重要。尽管Fx的提取产量仍不如使用甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）或丙酮（acetone）的浸渍提取方法，但提取物的纯度显著提高，Fx的柱回收率达到了75%，而使用这些方法时仅为20%

资助

我们非常感谢斯洛文尼亚研究机构（ARIS）通过项目P2-0046 L2-3175、J7-50129、J2-50048和GC-0007提供的支持。作者们也对“升级国家研究基础设施 - RIUM”项目中的资助表示感谢，该项目得到了斯洛文尼亚共和国、高等教育、科学和创新部以及欧盟欧洲区域发展基金的共同资助。

CRediT作者贡献声明

马莎·克内兹·马雷夫茨（Ma?a Knez Marevci）：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。 日尔科·克内兹（?eljko Knez）：监督、项目管理、资金获取、概念构思。 布拉兹·利科扎尔（Bla? Likozar）：监督、概念构思。 米哈·格里尔茨（Miha Grilc）：撰写 – 审稿与编辑、监督。 塔雅·日特克·马科特（Taja ?itek Makoter）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、资源准备。 马塞尔·久尔卡奇（Marcell Gyurkac）：撰写 – 原初草稿、可视化、资源准备、方法论研究、数据分析、数据管理。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Zeljko Knez表示，他获得了马里博尔大学化学与化学技术学院的财务支持以及文章发表费用。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

这项研究得益于“升级国家研究基础设施 - RIUM”项目提供的资助。我们衷心感谢斯洛文尼亚共和国、高等教育、科学和创新部以及欧盟（通过欧洲区域发展基金）的联合资助支持。

致谢