《Oncogene》：Genome-wide screening identifies ZFP91 as a key regulator of EVI1 in myeloid leukemia
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为阐明缺乏3q26结构异常的急性髓系白血病(AML)中EVI1异常高表达的机制，研究人员通过CRISPR全基因组筛选，首次发现锌指蛋白91(ZFP91)是EVI1的主要激活因子。ZFP91通过直接结合EVI1启动子、增强H3K4me3/H3K27ac修饰和染色质可及性来上调EVI1表达，ZFP91–EVI1轴在AML中起关键作用。该研究为EVI1高表达AML提供了新的治疗靶点。
在急性髓系白血病(AML)的治疗中，癌基因EVI1 (Ecotropic viral integration site 1)的高表达是一个公认的、与不良预后紧密相关的危险因素。它就像一颗“定时炸弹”，一旦在造血干细胞中异常激活，便会极大增强细胞的自我更新能力，同时抑制正常的分化进程，最终导致难治性白血病。以往，医生和科学家们已经知道，大约10%的AML患者存在EVI1高表达，其中一部分可归因于3号染色体q26区（3q26）的易位或倒位等结构性变异。这些变异会通过“增强子劫持”等机制，强行提升EVI1的表达。然而，临床上仍有大量EVI1高表达的AML病例，用常规的染色体核型分析技术并不能检测到3q26的异常。这就引出了一个核心的科学谜题：在这些没有明显染色体结构异常的病例中，究竟是什么力量在幕后驱动着EVI1的异常高表达？这个问题不解决，针对这部分患者的精准靶向治疗就无从谈起。
为了破解这一谜题，一支研究团队在《Oncogene》杂志上发表了一项突破性研究。他们意识到，传统的、基于已知转录因子结合位点的研究方法存在局限性，可能遗漏掉那些不依赖经典序列基序的新型调控因子。因此，他们决定采用一种不预先设定假设的、系统性的“钓鱼”策略——在全基因组范围内，寻找所有能够影响EVI1基因表达的调控因子。
主要技术方法
研究人员首先在表达高水平EVI1且无已知3q26异常的慢性髓系白血病急变期细胞系K562中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将绿色荧光蛋白(GFP)报告基因精确敲入到内源性EVI1基因的终止密码子位点，构建了K562-EVI1-GFP报告细胞系。随后，他们利用全基因组CRISPR敲除文库(GeCKOv2)对该细胞系进行筛选，通过流式细胞分选技术富集GFP荧光强度最高和最低的细胞群体，并通过测序分析两组细胞中向导RNA(sgRNA)的富集情况。此外，研究还综合运用了定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)、RNA测序(RNA-seq)、染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)、转座酶可及性染色质高通量测序(ATAC-seq)、荧光素酶报告基因检测以及细胞增殖实验等多种分子与细胞生物学技术，在K562、HEL等多个白血病细胞系中验证和深入阐明了关键调控因子的功能与机制。
研究结果
1. 全基因组筛选鉴定ZFP91为EVI1表达的主要激活因子
研究团队成功构建了GFP报告系统，并证实其荧光强度能可靠反映内源性EVI1的表达水平（图1A, B）。通过全基因组CRISPR筛选，他们发现，在GFP低表达细胞中富集的sgRNA所靶向的基因，是潜在的EVI1正调控因子。筛选结果不仅包含了EVI1基因本身(MECOM)和核糖体相关基因等阳性对照，还成功将锌指蛋白91(Zinc finger protein 91, ZFP91)锁定为排名靠前的全新候选激活因子（图1D）。在K562、HEL和CMK-11-5等多个EVI1高表达的白血病细胞系中，敲低或敲除ZFP91均能显著降低EVI1在mRNA和蛋白质水平的表达（图1E-H，图2B-E）。有意思的是，过表达ZFP91仅能在部分细胞中适度上调EVI1，表明ZFP91是EVI1高表达的必要但非充分条件。
2. ZFP91是EVI1表达的关键调控因子
为了深入理解ZFP91的功能，研究人员建立了ZFP91敲除的单克隆细胞系。RNA-seq分析显示，在ZFP91敲除的K562细胞中，下调最显著的基因正是MECOM (EVI1)（图2F）。基因集富集分析(GSEA)表明，ZFP91敲除与EVI1敲除所引起的全基因组转录组变化模式高度相似，两者均抑制了核糖体/线粒体相关基因，激活了细胞外基质相关基因（图3B-E）。进一步的GSEA交叉验证证实，ZFP91敲除与EVI1敲除所导致的上调或下调基因集存在大量重叠（图3F-I）。这些数据强有力地证明，EVI1是ZFP91下游的一个主要效应基因，ZFP91通过调控EVI1来影响全局的基因表达网络。
3. ZFP91结合EVI1启动子并激活其活性
ZFP91含有多个锌指结构域，既能作为非典型E3泛素连接酶，也被报道可作为转录因子发挥作用。研究人员发现，破坏任一锌指结构域都会损害ZFP91维持EVI1表达的能力，提示其功能依赖于完整的蛋白结构。ChIP-seq实验直接证实，ZFP91蛋白特异性地结合在EVI1基因的启动子区域（特别是EVI1-1A转录起始位点附近的启动子#1），而在整个拓扑关联结构域内未发现其他结合峰（图4A, B）。荧光素酶报告实验显示，ZFP91的敲除会显著降低EVI1启动子#1的活性，而对启动子#2活性影响不大（图4C, D）。序列分析发现启动子#1中存在特征性的ZFP91结合基序TTAAAG，破坏这些基序能模拟ZFP91敲除的效果，降低启动子活性（图4E-G）。表观遗传学分析进一步揭示，ZFP91敲除导致EVI1启动子区域的活跃组蛋白修饰（H3K4me3和H3K27ac）水平以及染色质可及性（通过ATAC-seq检测）均显著下降（图4B, H）。
4. EVI1是ZFP91的主要靶点之一
通过整合分析ZFP91的结合位点及其敲除引起的表观遗传和转录组变化，研究人员发现全基因组范围内仅有少数几个基因（包括EVI1和已知靶点IKBKE）同时满足以下条件：存在ZFP91结合峰，且该区域的H3K4me3、H3K27ac修饰和染色质可及性在ZFP91敲除后均显著降低（图5A, B）。这表明ZFP91的直接转录靶基因数量有限，EVI1是其中之一。进一步的足迹分析显示，ZFP91敲除后，全基因组范围内多个转录因子（包括已知的EVI1下游靶点如ERG和SPI1）的结合状态发生了改变，且这些变化在EVI1的ChIP-seq峰区域内更为显著（图5C-F）。这从另一个角度支持了ZFP91主要通过调控EVI1来重塑全局转录网络的结论。
5. ZFP91在EVI1相关白血病中的治疗潜力
功能上，敲除ZFP91能显著抑制K562和HEL白血病细胞的增殖（图5G, H）。对公共数据库(DepMap)的分析发现，在EVI1高表达的髓系白血病细胞系中，对ZFP91的依赖性显著高于EVI1低表达的细胞系（图5I），而此前研究已知多数EVI1高表达细胞系对EVI1本身并不依赖。这提示靶向ZFP91可能比直接靶向EVI1更具治疗价值。值得关注的是，临床使用的免疫调节药物(IMiDs)如泊马度胺(pomalidomide)可诱导ZFP91降解。实验证实，用泊马度胺处理K562细胞能同时降低ZFP91和EVI1的蛋白水平（图5J），为将现有药物用于靶向ZFP91-EVI1轴提供了初步依据。
结论与意义
本研究通过一项创新的、基于内源性报告基因的全基因组CRISPR筛选，首次系统性地揭示了在无3q26染色体异常的髓系白血病中，ZFP91是驱动EVI1异常高表达的一个关键上游调控因子。研究人员证实，ZFP91通过直接结合EVI1启动子，维持该区域活跃的组蛋白修饰状态和开放的染色质结构，从而持续激活EVI1的转录。ZFP91-EVI1调控轴的发现，为理解这一类预后不良的AML的发病机制提供了全新视角。
该研究的重大意义在于：
- 1.
方法论创新：建立了一种高效、无偏倚的筛选内源基因表达调控因子的通用策略，可广泛应用于其他基因和疾病背景。
- 2.
机制突破：破解了部分EVI1高表达AML缺乏传统染色体异常的谜团，提出了ZFP91依赖的转录调控新机制。
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转化医学价值：将ZFP91确立为潜在的治疗靶点。由于ZFP91敲除小鼠可存活，而EVI1对正常造血干细胞至关重要，因此靶向ZFP91可能在不严重影响正常造血的情况下，特异性抑制白血病细胞的EVI1表达，具有更好的治疗窗口。现有药物泊马度胺的降解作用，为快速开展临床前乃至临床验证提供了可能。
- 4.
疾病普适性：ZFP91和EVI1在多种实体瘤中均有异常表达，本研究发现的调控轴可能具有更广泛的肿瘤生物学意义。
总之，这项研究不仅深化了对AML，特别是高危EVI1高表达亚型的科学认知，更开辟了一条通过靶向ZFP91来干预EVI1致癌通路的新治疗途径，为未来开发更有效的精准疗法带来了希望。
