同时多生物标志物检测：基于链霉亲和素-生物素的高质量量子点免疫传感器及其信号放大技术

《Analytica Chimica Acta》：Simultaneous multi-biomarker detection: streptavidin-biotin mediated high-quality quantum dot immunosensor with signal amplification

1设计了一种基于streptavidin-biotin（SA-biotin）的量子点荧光信号放大免疫传感器，可在单微孔板中同时检测前列腺特异性抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）。通过引入长臂PEG修饰的生物素化二级抗体，显著提高了抗体负载效率并降低空间位阻，使检测限分别达到0.25 ng/mL（PSA）和0.32 ng/mL（AFP），较传统方法灵敏度提升6倍。临床血清样本验证显示该方法具有高准确性和特异性，适用于肿瘤标志物的早期高throughput多联检测。

　　

黄欢欣|张瑞雪|宁莉|李晓泉|佐伊·G·拉达|西奥查里斯·C·斯塔马塔托斯|陈欣欣|沈怀斌|徐当当|邢晓静|吴瑞丽|李林松

河南国际量子点材料联合实验室，河南大学纳米科学与材料工程学院，开封475004，中国

摘要

背景

开发高灵敏度、高通量且多路复用的肿瘤标志物检测方法对于早期癌症诊断至关重要。传统的链霉亲和素-生物素（SA-生物素）量子点（QD）免疫测定法往往难以在单一反应环境中同时检测多种生物标志物。本研究旨在通过设计一种高灵敏度的、基于SA-生物素介导的双色QD荧光信号放大免疫传感器，来克服这些限制，以实现在一个微孔板孔内同时检测前列腺特异性抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）作为模型分析物。

结果

该免疫传感器利用经过SA修饰的红色和绿色QD与生物素-PEG12-NHS酯修饰的二次抗体（Ab₂）结合，形成双色QD-SA-bio-Ab₂探针。这种结构利用了SA-生物素之间的高亲和力以及生物素-PEG12-NHS的长间隔臂，增加了抗体的负载量并减少了空间阻碍，从而产生了协同的信号放大效果。在优化条件下，该传感器对PSA和AFP的检测范围均为0.5至1000 ng/mL。检测限（LOD）分别为PSA的0.25 ng/mL和AFP的0.32 ng/mL——大约是标准双色QD基免疫传感器的6倍。通过回收测试和临床血清样本分析验证了该平台的准确性，其结果与目前流行的检测技术相当。

意义

所提出的双色QD-SA-bio-Ab₂探针提供了一个通用的荧光平台，克服了传统检测方法的多路复用限制。通过将高性能QD与策略性的PEG间隔臂结合，该方法为荧光增强提供了一种新方法。这代表了在临床诊断中实现高灵敏度、高通量多路复用检测方面的重大进步。

引言

量子点（QD）由于其独特的光学特性（包括高量子产率（QY）、优异的光稳定性以及相同的激发下产生的多种荧光发射）[1]、[2]、[3]、[4]、[5]，已成为生物分析应用中非常有前景的荧光标记物。基于QD的免疫测定法相比传统方法具有显著优势，如更高的灵敏度、更宽的动态范围和多组分检测能力[6]、[7]、[8]、[9]。在传统的基于QD的免疫测定法中，通常使用标记有QD的抗体作为信号标记物，但其分析性能受到QD质量和与目标结合的QD数量的限制，这使得它们在检测低丰度目标或实现超灵敏检测时效果较差。研究人员尝试通过制备含有多个QD的大微球来克服这一限制[9]、[10]、[11]、[12]。然而，这种方法通常涉及复杂的合成和修饰过程，且大微球带来的空间阻碍可能会显著降低抗原-抗体结合效率。因此，可控地合成高质量QD并开发高灵敏度生物传感器具有重要意义。

链霉亲和素-生物素（SA-生物素）系统由于其高特异性、强结合亲和力以及在多种反应条件和生物环境中的可靠性能，已成为提高检测灵敏度和信号放大的强大工具[13]、[14]、[15]、[16]。作为四聚体蛋白，SA可以通过化学修饰与纳米材料结合，以创建功能性探针[17]。生物素是一种相对较小的分子，通常可以附着在抗体（Ab）上而不影响其生物活性[18]。生物素与亲和素之间的相互作用是已知最强的非共价相互作用，亲和常数（K）为10¹⁵ mol/L——至少比抗原（Ag）与Ab之间的亲和常数（K=10⁵-10¹¹ mol/L）高10,000倍。此外，生物素化的Ab（bio-Ab）有助于免疫测定中的信号放大[19]。这种保持附着部分化学和生物特性的简单构建过程使得SA-生物素系统成为一个多功能纳米技术平台。目前，SA-生物素系统已应用于多个研究领域，如免疫标记、靶向药物递送和细胞追踪[20]、[21]、[22]。然而，该系统的一个关键限制是由于需要逐步添加SA标记材料和bio-Ab，导致操作复杂性增加，不适合在一次测试中同时检测多种标志物。

然而，同时检测多种癌症标志物可以实现多维信息的交叉验证，减少单指标检测中可能出现的假阳性或假阴性风险，从而提高诊断的特异性和准确性[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。联合检测可以通过单次采样实现多疾病筛查的协同效应，不仅提高了检测效率和时效性，还为临床实践提供了更全面的疾病风险信息，为个性化癌症预防计划和早期诊断奠定了基础。传统的肿瘤标志物检测技术存在一些局限性，包括灵敏度低、检测范围窄以及无法进行多组分分析[28]。为了提高癌症诊断的灵敏度，特别是实现多组分检测的需求，已经开发了多种方法，包括功能性液晶传感器[24]、电化学生物传感器[29]和荧光生物传感器[6]、[30]。然而，在临床检测应用中仍存在稳定性和可靠性方面的挑战。因此，迫切需要新的诊断平台，以实现更准确、多路复用和高通量的肿瘤标志物分析，同时提高其灵敏度。

在这项研究中，我们开发了一种基于SA-生物素介导的信号放大QD免疫传感器，能够在一次测试中同时检测两种肿瘤标志物（图1，称为双SA-生物素信号放大QD免疫传感器）。该免疫传感器将红色和绿色QD偶联的SA（red-QD-SA和green-QD-SA）以及生物素偶联的二次抗体（bio-Ab₂）集成到一个预组装的检测探针中（称为red&green QD-SA-bio-Ab₂），用于多路复用检测。作为临床诊断中的两种关键肿瘤标志物，前列腺特异性抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）的精确检测具有重要意义[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]。采用PSA和AFP作为模型系统进行的原理验证研究表明，所提出的免疫传感器具有高灵敏度和特异性。首先，通过利用SA-QD和bio-Ab₂之间的优异特异性和强结合亲和力，制备了高质量的双色QD-SA-bio-Ab₂（red-QD-SA-bio-PSA₂和green-QD-SA-bio-AFP₂）荧光探针（图1a）。这种工程化的探针具有几个优点：（1）增强了QD-Ab₂的结合效率，提高了Ab₂在QD表面的负载量；（2）通过引入长链生物素-PEG12-NHS酯，优化了QD与目标抗原之间的空间分离，从而最小化了抗原-抗体相互作用中的空间干扰；（3）能够在单个孔中同时检测两种抗原。随后，通过特定的抗原-抗体结合以及双色QD的荧光信号变化实现了PSA和AFP的同时检测（图1b₁），而这无法通过使用red&green QD-SA作为探针的逐步SA-生物素QD免疫传感器实现（图1b₂）。结果表明，构建的双SA-生物素信号放大QD免疫传感器显著增强了荧光信号强度，同时提高了癌症生物标志物检测的灵敏度、准确性和特异性。这对于早期检测和精确诊断肿瘤具有重要意义，特别适用于高通量临床应用。

材料与仪器

实验中使用的试剂、仪器和蛋白质样本的详细信息见补充信息。

实验程序的准备工作

有关以下程序的详细准备，请参阅补充信息：疏水性CdSe/ZnS红色QD（峰值623 nm）、疏水性ZnCdSe/ZnS绿色QD（峰值523 nm）、二氧化硅包覆的红色QD（red-QD@SiO₂）、二氧化硅包覆的绿色QD（green-QD@SiO₂）、双色SA修饰的QD@SiO₂探针（分别命名为red-QD-SA和green-QD-SA）

双色QD@SiO₂的特性

使用红色CdSe/ZnS QD的主要优势在于它们具有强烈的I型带对齐特性，这导致激子波函数在核心内强烈局域化，从而禁止了与表面扰动的任何潜在相互作用（图S1a）。对于绿色QD，我们在核心中引入了Zn元素以形成合金结构，这有助于增加带隙而不减小核心尺寸（图S1b）。红色CdSe/ZnS和绿色ZnCdSe/ZnS疏水性QD

结论

总之，开发了一种新型的双SA-生物素信号放大QD免疫传感器，能够在一次测试中同时高灵敏度地检测多种肿瘤标志物。在这种方法中，QD和Ab通过SA-生物素系统连接，增加了抗体在QD表面的负载量以及抗原-抗体的结合效率，同时减少了抗原-抗体反应的空间阻碍并实现了信号放大。更重要的是，

CRediT作者贡献声明

沈怀斌：资源管理、项目协调、资金获取。陈欣欣：数据管理。邢晓静：写作 - 审稿与编辑、监督、资源管理。徐当当：写作 - 原稿撰写、可视化、监督、项目协调、方法学研究、资金获取、数据分析、概念化。李林松：资源管理。吴瑞丽：写作 - 审稿与编辑、监督、方法学研究。张瑞雪：方法学研究、实验设计、数据分析

未引用的参考文献

[32]、[33]、[34]、[35]。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号21905074）、河南省科学技术项目（编号252102231050、25B150008）、河南省卫生健康委员会（资助编号395LHGJ20240388）以及河南大学化学科学系的合作项目（编号DCSHENU2422）的支持。