一种预整合的dCas9-VPR CRISPRa平台，用于在CHO细胞中高效生产重组蛋白

《Biochemical Engineering Journal》：A Pre-integrated dCas9-VPR CRISPRa Platform for High-Level Recombinant Protein Production in CHO Cells

基于CRISPR/dCas9-VPR的合成转录激活平台在CHO细胞中显著提升重组蛋白生产效率，通过预整合dCas9-VPR构建稳定的车架细胞系，在连续流培养中实现96.17 pcd的峰值比生产速率，并维持60天以上的稳定表达。

　　

袁天|周雅楠|胡万顺|徐娇|叶倩|谭文松

华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，中国上海200237

摘要

使用强启动子对于提高重组治疗蛋白（RTP）的产量至关重要，但传统的工程策略难以超越人类巨细胞病毒（hCMV）启动子的强度。虽然CRISPR激活（CRISPRa）系统能够提供精确且可调节的调控，并且可以被设计成超过hCMV的活性。因此，我们构建了一个基于dCas9-VPR的合成转录激活平台，在瞬时转染后显示出比hCMV启动子高1.7倍的激活水平。然而，CRISPRa系统的多组分性质使得生成稳定的生产细胞系变得复杂。因此，我们开发了一种预集成dCas9-VPR的创新底盘细胞系。这种设计通过仅用一个目标基因质粒进行转染来简化工作流程。该底盘细胞表现出强大的性能，在60天内实现了比hCMV启动子高1.5倍的瞬时激活水平。与hCMV启动子相比，该平台显著提高了多种重组蛋白的表达水平。在 fed-batch 培养中，该系统的最大比生产率（q_P）达到了44.38 pcd，抗体滴度峰值达到了5.92 g/L。在 perfusion 培养中，累积滴度达到了17.15 g/L，平均和峰值q?值分别为62.28 pcd和96.17 pcd，接近CHO细胞的报道上限。这项研究为高产重组治疗蛋白的生产提供了一种有前景的策略。

引言

重组治疗蛋白（RTPs）是一类主要的生物制药产品，目前大约70%的批准RTPs是使用哺乳动物细胞表达系统制造的[28]、[39]、[49]。在哺乳动物细胞中，转录是一个由多个顺式作用DNA元件及其相应的反式作用因子共同调控的复杂过程，其中启动子在整合和传递转录信号中起着关键作用[27]。提高重组蛋白表达的一个关键策略是使用强启动子，例如病毒来源的启动子。人类巨细胞病毒主要立即早期增强子/启动子（hCMVp）因其高初始转录活性而被广泛使用[30]、[44]；然而，它容易受到DNA甲基化介导的表观遗传沉默的影响，从而导致表达不稳定[38]、[55]、[63]。为了减轻甲基化引起的不稳定性，已经探索了各种策略，包括甲基化位点的突变[33]、[55]、将表达盒有针对性或半针对性地整合到转录活跃的基因组区域[44]、[59]，以及使用染色质开放元件（例如UCOEs）[35]。在过去十年中，提高启动子强度的努力通常涉及通过易出错的PCR（EP-PCR）、合成DNA寡核苷酸或“启动子杂交工程”[3]、[51]、[6]、[63]、[7]来实现。真核转录因子及其DNA结合位点的结构复杂性和多样性构成了重大挑战[41]、[56]。因此，尽管大多数研究集中在优化核心启动子[19]、[40]和近端增强子元件[17]上，但启动子强度的提高仍然非常有限。

合成生物学的最新进展促进了人工设计转录调控平台的发展，使得能够精确控制基因表达水平[10]、[29]。构建这样的平台依赖于建立高效的转录激活系统。在过去的十年中，成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因编辑工具由于其灵活性和操作简便性而得到了广泛应用，超越了其他基因编辑工具[20]，在常见的应用中如位点特异性整合转基因[61]或敲除特定基因[39]。催化失活的Cas9（dCas9）可以与转录激活结构域（TADs）融合，以构建CRISPR激活（CRISPRa）系统[20]。第一代CRISPRa系统通常将dCas9与单个激活结构域（例如VP64[52]、RTA[15]或p65[37]）融合，但它们的激活强度有限，主要应用于基因治疗[36]。随着系统的进化，第二代CRISPRa平台（如dCas9-VPR，包含VP64、RTA和p65）显著增强了激活能力，对于各种目标基因的激活强度比dCas9-VP64提高了22到320倍[8]。此外，通过调整引导RNA（gRNA）类型和结合位点数量，或引入内含子，可以进一步增强转录激活效果。例如，William C. W.等人开发的合成可编程转录系统实现了比延长因子1-α（EF1α）启动子高25倍的激活能力[10]。这些进展表明，CRISPRa系统不仅对基因治疗具有潜力，也为重组治疗蛋白的生产提供了新的可能性。

然而，将CRISPRa应用于重组蛋白生产仍然面临挑战。典型的CRISPRa系统需要三个模块：dCas9-VPR蛋白、gRNA和目标蛋白表达盒。将这些模块分布在三个质粒上以进行一步整合会降低获得稳定转染细胞池的效率，并需要多种抗生素进行筛选，增加了操作复杂性[26]。将这三个模块构建在单个质粒上会导致载体大小过大，通常超过两个转录单元的负载能力[26]，同时增加了转染和整合的难度[23]、[58]，并可能导致整合片段化[59]。即使上述组件可以通过单次事件同时整合，William C. W.等人的研究表明，其激活效力并没有显著提高，只是增强了表达稳定性[10]，这表明在Chinese hamster ovary（CHO）细胞中应用CRISPRa进行稳定重组蛋白生产仍存在瓶颈。

为了充分利用CRISPRa系统的优势，并将其应用于CHO细胞的重组蛋白生产，同时简化操作流程，本研究进行了以下工作。首先，我们设计并比较了两种转录激活策略：一种是将gRNA结合位点（gRNA BS）直接嵌入hCMVp序列；另一种是从头构建基于CRISPRa的合成转录平台。通过系统优化关键元素，包括gRNA BS组成[10]、核心启动子类型[19]、[40]和内含子[43]、[54]，开发了基于CRISPR的人工转录因子（crisprTF）启动子。为了解决使用该系统生成稳定细胞系的操作复杂性，采用了预集成dCas9-VPR的策略来构建通用底盘细胞系，然后筛选出具有高且持续转录激活能力的克隆系。为了克服长dCas9-VPR编码序列稳定整合的挑战，使用PiggyBac（PB）转座子系统结合经过验证的内源性弱启动子选择策略实现了高效稳定的整合。最后，为了系统验证预集成dCas9-VPR底盘细胞系和crisprTF启动子在重组蛋白生产中的适用性和性能，我们利用该平台表达了多种目标蛋白，包括荧光蛋白、单克隆抗体和多种复杂蛋白，并评估了它们在fed-batch和perfusion培养过程中的稳定和高产能力。这项研究提供了一种高效、稳定且操作简化的新型合成生物学工具，用于重组蛋白生产。

节选

分子克隆和质粒构建

dCas9-VPR基因序列来源于AAVS1-idCas9-VPR质粒（Addgene，美国）。通过PCR扩增后，将其与来自UCOE表达载体（Novagen，美国）的Rps3 UCOE元件和T2A?copGFP序列一起，通过同源重组组装到线性化的PB513B?1骨架载体（Addgene，美国）中，构建了一个稳定的表达盒。CrisprTF启动子的组成部分，如gRNA、gRNA BS、核心启动子和内含子，都是合成的

基于CRISPR/dCas9-VPR的转录激活系统设计

在真核细胞中，基因转录起始依赖于转录因子与启动子区域之间的相互作用。启动子包含许多转录因子结合位点（TFBS）。转录因子通常具有用于特定序列识别的DNA结合结构域和用于将RNA聚合酶II招募到核心启动子以激活转录的激活结构域。根据类似原理（图1A），CRISPR激活（CRISPRa）系统

讨论

为了提高重组蛋白的表达水平，生物制药行业目前广泛使用强病毒启动子（如hCMVp）来驱动目标基因[51]。然而，研究表明，CMV启动子的甲基化是导致长期细胞传代过程中比生产率（q_P）下降的主要因素[22]、[38]、[4]、[55]。尽管突变CMV启动子中的胞嘧啶位点可以部分缓解表达不稳定[21]、[33]，但发现

结论

在这项研究中，我们基于CRISPR/dCas9-VPR在CHO细胞中建立了一个高效的合成转录平台，其激活强度比传统的hCMV启动子高1.7倍。我们首次创新性地通过预集成构建了一个稳定的dCas9-VPR底盘细胞系，其激活强度比hCMVp高2.0倍，并显著简化了CRISPRa在稳定重组蛋白表达中的应用。该平台还进行了评估

CRediT作者贡献声明

谭文松：资源获取、资金筹措、概念构思。叶倩：写作 – 审稿与编辑。徐娇：写作 – 审稿与编辑。胡万顺：写作 – 审稿与编辑。周雅楠：写作 – 审稿与编辑。袁天：写作 – 审稿与编辑、原始草稿编写、可视化、验证、数据分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作