一项采用13Cβ CEST技术的实验，其灵敏度得到了提升，有助于更精确地表征蛋白质的激发态

《Journal of Magnetic Resonance》：A 13Cβ CEST experiment with improved sensitivity for the characterization of protein excited states

本研究提出一种改进的非恒定时间CEST实验方案，针对不同残基类型优化参数，显著提升灵敏度，成功用于测定pro-IL-18 Q54V突变体中低丰度激发态的化学位移，为解析蛋白质构象动态提供新方法。

　　

杰弗里·P·博宁（Jeffrey P. Bonin）| 刘易斯·E·凯（Lewis E. Kay）

多伦多大学分子遗传学与生物化学系，加拿大安大略省多伦多市，M5S 1A8

摘要

蛋白质的功能往往依赖于从高占据率的基态短暂转变为低占据率的构象，即“激发态”。与其他大多数生物物理方法不同，核磁共振（NMR）光谱技术提供了一种量化这些转变的动力学和热力学特性的方法，并通过化学交换饱和转移（CEST）等实验测量获得参与构象的结构信息。与许多NMR应用一样，灵敏度和分辨率之间存在权衡，这种权衡可能会对最终数据的质量产生负面影响。一个例子是(Fawzi等人，2012¹³)C^β CEST实验，该实验通常使用三共振方案进行，并读取主链酰胺的相关性数据。由于多次磁化转移步骤导致的灵敏度降低，使得该技术难以应用于那些交换过程贡献较大的蛋白质系统。在这里，我们提出了一种非恒定时间的(Fawzi等人，2012¹³)C^β-(Karplus和Kuriyan，2005¹)H^β版本的(Fawzi等人，2012¹³)C^β CEST实验，该版本针对每种残基类型进行了优化，从而显著提高了灵敏度。在对pro-白细胞介素-18（pro-interleukin-18）Q54V变体的应用中，这种灵敏度的提升对于确定(Fawzi等人，2012¹³)C^β化学位移至关重要，因为这些残基在基态和一对激发态之间转换。本文介绍了实验的技术细节。

引言

蛋白质是动态分子，其功能可能涉及从高占据率、低能量的基态短暂转变为低占据率、高能量的构象（以下称为激发态）[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。尽管结构生物学的研究主要集中在通过实验或机器学习（ML）方法[6]、[7]来表征生物分子的基态构象，但人们越来越意识到，需要进一步研究以了解动态变化在调节生物分子功能中的重要作用。然而，这类研究面临的一个挑战是高能量构象具有瞬态性和低占据率，因此往往只能通过基态间接“观察”到。诸如Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）松弛分散[8]、[9]、[10]、[11]、化学交换饱和转移（CEST）[12]、暗态交换饱和转移（DEST）[13]以及R_1ρ松弛分散[14]、[15]、[16]等实验为“看见不可见的事物”提供了途径，并已被用于量化蛋白质[2]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]和核酸[23]、[24]以及较小分子[25]中的交换过程的动力学和热力学特性。此外，化学位移和残基各向异性相互作用等形式的结构信息有时足以生成可靠的激发态构象集合[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。已经对各种不同的系统进行了研究，从而揭示了酶促反应[2]、[5]、蛋白质折叠和错误折叠[26]、[27]、配体结合和分子识别[34]以及对抗疾病的药物耐药性发展[3]的机制。

上述每种NMR方法都适用于特定时间范围内的动态研究。根据我们的经验，CEST特别适合探索毫秒级时间尺度的过程，因为激发态的化学位移可以直接从CEST谱图中的微小“凹陷”位置获得，而不需要像分析CPMG数据[11]那样依赖拟合算法来定位误差表面的全局最小值。此外，由于CEST实验使用数十赫兹的弱射频场来探测不可见状态，因此它们对同核标量耦合的影响相对不敏感[35]，而这些耦合在CPMG实验中可能会产生显著的伪影。因此，CEST可以方便地应用于研究均匀标记有¹³C的样品中的主链和侧链¹³C自旋[36]，从而更详细地表征激发态的结构。

十多年前，我们的实验室提出了一对基于三共振的方案来记录¹³C^α和¹³C^β CEST谱图，通过后续残基的酰胺相关性进行读取[37]。这些实验的优点在于¹H^N-¹⁵N谱的分辨率明显优于相应的¹H^α-¹³C^α或¹H^β-¹³C^β相关图谱，但这种方法的CEST数据集由于需要多次磁化转移步骤而牺牲了灵敏度，尤其是对于基于¹³C^β的实验而言。虽然使用恒定时间方法的¹H-¹³C实验的分辨率得到了提高，但灵敏度与分辨率之间的权衡仍然存在问题。

在这里，我们描述了对之前开发的¹H-¹³C类CEST实验的改进，用于测量¹³C^β化学位移[36]，以研究22 kDa蛋白质pro-白细胞介素-18（pro-IL-18）的构象动态。当只需要测量少数几个¹³C^β化学位移时，这种方法特别有效，例如在我们对pro-IL-18的研究中，之前已经确定了该蛋白质中的构象异质性区域[17]。通过根据具体残基或残基类型调整实验参数（如在针对氘代蛋白质侧链的¹³C检测实验[38]以及针对蛋白质和RNA的R_1ρ实验[39]、[40]中所做的那样），可以获得显著的灵敏度提升，从而能够准确量化激发态的化学位移，而这些化学位移在其他方法中是无法获得的。

实验片段

样品制备

使用我们之前建立的方案[41]，从大肠杆菌中表达了pro-IL-18（野生型WT和Q54V）的同位素富集样品，并进行了纯化。样品由1 mM蛋白质溶解在20 mM MES、50 mM KCl、0.5 mM EDTA和10 mM DTT缓冲液中组成，pH值为6.5，含有3% D₂O。

NMR光谱

NMR实验在25°C下对Q54V pro-IL-18进行，在40°C下对WT蛋白质进行，使用的设备分别是Bruker AVANCE III HD 18.8 T（800 MHz，¹³C^β-¹H^β实验）和AVANCE III HD 14.1 T（600 MHz，三共振酰胺基实验）

问题

使用CPMG/CEST策略研究22 kDa蛋白质pro-IL-18的构象动态时，我们之前发现WT分子在基态和一对激发态ES₁和ES₂之间转换，这两种激发态的占比较高约为0.5%[17]。这些低占据率的激发态导致CPMG松弛谱图较小（约5 s^?1），并且在CEST实验中产生微小的次要状态凹陷。Q54V突变被证明可以稳定这两种激发态，

CRediT作者贡献声明

杰弗里·P·博宁（Jeffrey P. Bonin）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法论、数据分析。刘易斯·E·凯（Lewis E. Kay）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、方法论、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：刘易斯·E·凯和杰弗里·P·博宁报告称获得了加拿大卫生研究院（Canadian Institutes of Health Research）的财务支持。刘易斯·E·凯还报告获得了加拿大自然科学与工程研究委员会（Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada）的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能构成利益冲突。

致谢

本工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR，FND-503573）和加拿大自然科学与工程研究委员会（024-03872）的资助。J.B.感谢CIHR提供的博士后奖学金形式的薪资支持。