《Methods》：Real-time, label-free assessment of cell fusion dynamics by high-content imaging
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细胞融合实时动态分析的高内容活细胞成像方法开发及验证，以BeWo细胞模型为研究对象，建立无标记自动化分析流程，整合纹理分割、形态测量和灰度独立纹理分析，定义融合特异性定量指标，并通过药理学调控和高通量筛选验证方法可靠性。
Sandip Shinde | Anshul Bhide | Pratik Rasal | Deepak Modi
分子与细胞生物学实验室，印度医学研究委员会（ICMR）国家妇女健康研究所（ICMR-NIRWoH），前身为印度医学研究委员会（ICMR）国家生殖与儿童健康研究所，地址：JM Street, Parel, Mumbai 400012, 印度
摘要
细胞融合是一种基本的生物过程，它涵盖了多种生理和病理现象。然而，由于其动态性、异质性和多步骤的特性，对其进行定量分析在方法上仍然具有挑战性。现有的融合评估方法主要依赖于终点检测或手动评分，这限制了时间分辨率、可扩展性和重复性。在这里，我们提出了一种无标记的高通量活细胞成像技术，用于实时定量分析细胞融合动态，该技术以滋养层合胞化为模型系统进行了开发和验证。
该方法结合了自动图像采集和可重复的逐步分析工作流程，包括基于监督的纹理分割、基于形态的测量以及与强度无关的纹理分析。我们定义了定量指标，如总细胞团面积与检测到的细胞团数量之比以及细胞质颗粒度特征，这些指标能够区分真正的融合事件与非融合相关的细胞聚集或增殖现象。通过使用经典的融合诱导剂和抑制剂，我们证明了这些参数在检测随时间变化的融合相关重塑方面的特异性和敏感性。
我们进一步通过高通量筛选生物相关的生长因子、激素和抑制剂来展示该技术的可扩展性，从而能够根据它们对融合动态的独立、协同或拮抗作用对调节因子进行分类。在独立模型中获得的一致结果进一步支持了其在其他融合系统中的应用潜力。通过提供一个稳健、可重复且适应性强的时间分辨融合分析框架，该方法架起了定性观察与定量动力学评估之间的桥梁。因此，经过系统特定参数优化后，该方法可以很容易地扩展到其他细胞融合系统，为机制研究和发现驱动的筛选应用提供了一个多功能平台。
引言
细胞融合在多种生理和病理条件下都是一种基本的生物过程。从生理学角度来看，细胞融合对于正常发育和组织稳态至关重要，例如在骨骼肌形成过程中的肌母细胞融合、骨重塑过程中的破骨细胞分化、胎盘发育过程中的滋养层融合以及病毒感染过程中的合胞体形成 [1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。失调或异常的细胞融合与癌症进展、组织修复、炎症和传染病有关 [8]、[9]、[10]。尽管细胞融合具有广泛的生物学意义，但由于其动态性、异质性和多步骤的特性，对其进行定量表征在技术上仍然具有挑战性。
在大多数实验系统中，细胞融合是通过终点检测或半定量方法来评估的 [11]。这些方法包括基于免疫染色的融合指数、多核细胞计数、报告基因检测或融合相关基因表达和分泌因子的测量 [12]、[13]、[14]。虽然这些方法在识别融合的分子调节因子方面发挥了重要作用 [15]、[16]、[17]、[18]、[19]，但它们只能提供连续过程的静态快照，并且在捕捉融合动力学、中间状态和细胞群体内的时间异质性方面存在局限性。此外，许多常用的检测方法依赖于手动评分或主观解释，从而降低了重复性和可扩展性。
活细胞成像技术可以直接实时观察融合事件 [20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。然而，现有的活细胞成像方法通常受到视野有限、通量低或依赖荧光标记策略的制约，这些策略可能会干扰细胞行为 [26]、[27]、[28]、[29]。此外，缺乏标准化的自动化分析流程阻碍了从时间分辨成像数据中提取可靠的定量指标 [30]。一个核心的方法学挑战在于区分真正的融合事件与其他过程（如细胞聚集、增殖或迁移），因为在无标记成像模式下，这些过程可能会产生表面相似的形态结果。
高通量筛选（HCS）平台结合了自动化显微镜和先进的图像分析技术，为解决这些挑战提供了强有力的解决方案 [25]、[31]、[32]、[33]、[34]。HCS能够大规模地多参数、时间分辨地量化细胞表型，并已广泛应用于细胞活力、分化、迁移和药物反应分析 [24]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]。然而，尽管其应用广泛，但目前仍缺乏专门为实时无标记定量分析细胞融合动态而设计的经过验证的方法。特别是，整合了分割、基于形态的测量和纹理分析的分析框架尚未得到充分发展。
滋养层合胞化是一个稳健且易于实验操作的模型系统，可用于开发和验证此类方法。在体外条件下，人绒毛膜癌来源的BeWo细胞系在环磷酸腺苷（cAMP）信号作用下会发生可重复的细胞融合，这种信号通常由佛斯高林（forskolin）诱导 [39]、[40]。该系统已被广泛用于研究融合的分子调控机制，并提供了特征明确的药理调节因子，使其非常适合用于基准测试定量融合检测 [16]、[17]、[18]、[19]。
在这里，我们提出了一种高通量活细胞成像技术，用于实时评估和量化细胞融合，以BeWo细胞合胞化为模型应用。该方法结合了自动图像采集和可重复的逐步分析工作流程，包括基于监督的纹理分割、基于形态的指标以及与强度无关的纹理分析。我们定义并验证了能够敏感捕捉融合动力学并区分真实融合事件与非融合相关细胞重排的定量参数。我们进一步通过将其应用于高通量筛选生物相关因子来展示该方法的可扩展性，突显了其在不同细胞融合背景下的潜在实用性。
章节片段
细胞培养和细胞融合诱导
BeWo人绒毛膜癌细胞（ATCC）和HeLa细胞（ATCC）在添加了15%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液（Gibco）的DMEM/F12（1:1）培养基（HiMedia）中培养。细胞在37°C、5% CO2的潮湿培养箱中维持，并在75–80%的汇合度时传代，培养基每隔一天更换一次。定期检测细胞中的支原体，如果阳性，则使用商业试剂盒（HiMedia）进行消除。
对于融合实验，细胞被...
在BeWo模型系统中验证细胞融合诱导
为了建立一个用于验证定量融合指标的参考系统，我们首先使用传统的分子和形态学方法确认了佛斯高林诱导的BeWo细胞融合。经过48小时的佛斯高林（50 μM）处理后，细胞表现出离散细胞边界的丧失和多核结构的形成，这与合胞体融合一致（图2A-F）。定量分析显示佛斯高林处理后的细胞皮层F-actin组织显著减少。
讨论
在这项研究中，我们开发并验证了一种无标记的高通量活细胞成像技术，用于定量分析细胞融合动态。以滋养层合胞化为模型系统，我们证明了常用的单参数描述符（如总细胞面积）不足以在活细胞成像数据集中区分真正的融合事件和由增殖驱动的细胞聚集。通过结合基于簇的形态学扩展和基于纹理的颗粒度分析...
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们对我们同事兼第一作者Sandip Shinde的逝世深表哀悼，他对这项工作的构思和执行做出了重要贡献。我们将这项研究献给他。
我们感谢ICMR对DM的资助，以及CSIR-SRF对AB的资助。我们感谢ICMR-NIRWoH的Bhakti Pathak博士提供BeWo细胞，以及ICMR-NIRWoH的Vikrant Bhor博士分享HeLa细胞。ChatGPT-5.2协助了手稿的语言编辑。
