高质量染色体级别的基因组组装技术，用于解析Stipa grandis的基因组进化及其在全基因组转录水平上对渗透压胁迫的响应

《Polymer Chemistry》：High-quality chromosome-level genome assembly for deciphering genome evolution and the whole transcriptomic response to osmotic stress in Stipa grandis

　　岳梦|岳翠|文静葛|刘雅楠|霍婷瑜|田云云|孙振芸|张叶明|李嘉泽|党振华
中国内蒙古大学生态与环境学院草原生态学与资源利用教育部重点实验室及内蒙古高原生态学重点实验室，呼和浩特010021

摘要
持续的干旱化促使植物向更适宜的生境迁移，并促进了基因组的进化，从而推动了物种形成。大针茅（Stipa grandis）是蒙古草原生态系统中的优势种，具有出色的耐旱能力。本研究首次构建了高质量的大针茅染色体级别的基因组，其BUSCO完整性达98%，LTR组装指数为27.01。对禾本科（Pooideae）祖先核型的同线性分析显示其进化轨迹与水稻相似，而非共线染色体融合是导致结构分化的主因。比较基因组分析发现了一次不同于ρ事件的整基因组复制事件，同时还发现了在抗旱相关通路中显著扩增和重复的基因家族，如抗氧化防御、信号转导和次生代谢产物生物合成相关基因。通过整合渗透胁迫下的全转录组数据，我们鉴定了大针茅叶片和根部分布差异表达的mRNA、lncRNA和miRNA的组织特异性表达模式。研究发现，根部对渗透胁迫的敏感性较高，miRNA在调节激素信号通路和能量稳态过程中起着关键作用。核心激素信号通路和碳代谢通路（如淀粉向蔗糖的转化）被协同激活，以优化根系结构和碳再分配，加快地上和地下器官的能量转换。关键调控因子包括ABF和DELLA基因、miRNA-95-3p-ARF和miRNA-7-3p-BRI1调控模块以及控制淀粉储存的lncRNA-AGPase。本研究揭示了大针茅抗旱能力的基因组和分子基础，为进一步的功能研究提供了候选基因，并为草原植物的适应性进化提供了新见解。

1. 引言
基因组包含了一个生物体的所有染色体DNA及相关调控结构。面对不断变化的气候和环境不稳定，植物基因组预计会经历大量的结构变化（如复制、缺失、倒位和易位）以及选择驱动的精细化。这些动态过程不仅保留了长期进化过程中物种与环境相互作用形成的遗传印记，还为适应性策略建立了分子框架。在全基因组复制（WGD）过程中，植物多样化和适应性得到了关键推动（Panchy等人，2016）。在单子叶植物进化中，几次已明确的WGD事件显著促进了草类的起源、多样化和生态成功（Lee等人，2020；Wu等人，2020；Zhang等人，2022a）。例如，约1000万年前的异源多倍化事件发生在Orinus（以Orinus kokonorica为代表）和Cleistogenes（以Cleistogenes songorica为代表）属中，这一事件显著提高了这些植物的耐旱能力。在干旱胁迫下，这两个物种中超过一半的差异表达基因（DEGs）是功能保守的直系同源物；而在寒冷和热胁迫下，分别有98%和89%的直系同源DEGs表现出功能分化（Qu等人，2023）。在Oropetium thomaeum中，从古老的ρ-WGD事件中保留下来的4,209对同源基因对在基因调控功能和胁迫响应中富集，包括转录因子活性、氮代谢、盐胁迫响应和含氧化合物响应（VanBuren等人，2015）。通过植物与环境之间的相互作用，WGD产生的重复基因会经历选择性保留、修饰或消除，从而驱动新的基因表达和调控网络的形成，这些网络控制着适应性性状并影响生物体的适应性（Gibson，2008；Kenkel和Matz，2016）。在这一过程中，非编码RNA（ncRNAs）介导的转录后调控日益被视为此类适应的关键系统（Richards，2006；Bossdorf等人，2008；Holeski等人，2012），大量研究表明ncRNAs在植物对非生物胁迫的响应中起重要作用（Han等人，2020）。例如，microRNA miR393靶向F-box蛋白基因，调节生长素信号通路，影响植物的发育、根系结构和气孔密度（Chen等人，2011；Windels和Vazquez，2011；Bian等人，2012；Lu等人，2018；Yuan等人，2019；Zhao等人，2019；Jiang等人，2022）。miR169通过靶向NF-YA转录因子参与干旱条件下的水分平衡和气孔调节（Luan等人，2014；Luan等人，2015；Xu等人，2016；Li等人，2021；Chen等人，2024）。长链非编码RNA（lncRNAs）通过调节脱落酸（ABA）信号通路促进抗旱性（Qin等人，2017）。因此，探索ncRNAs的多样性和调控复杂性对于深入理解植物发育、耐逆性和抗病性至关重要。这些知识将对气候变化和日益增加的人为压力背景下植物的适应性机制提供关键见解（Waititu等人，2020）。

自第三纪中新世以来，中欧亚大陆的干旱化趋势加剧，使得半干旱和适应干旱的物种在欧亚草原植物群中占据主导地位（Bin等人，2014；Shuya等人，2016；Bredenkamp等人，2002）。大针茅属（Stipa）最初出现在渐新世，并在晚第三纪成为草原植物群中的优势组成部分（Yan等人，2025）。中新世之后，中欧亚、北美和南美的现代温带草原逐渐形成（Miao等人，2012）。大针茅（Poaceae，2n = 44）是分布在中亚蒙古草原地区的多年生丛生草本植物，属于Stipa属的Capillatae组。该种主要分布于中国内蒙古东部和中部、宁夏、甘肃和青海（Hamasha等人，2012；Romaschenko等人，2012）。大针茅是典型草原生态系统中的气候顶级植被，在中国北方具有重要的生态屏障作用。由于其丰富的基生叶、高适口性、营养价值和越冬能力，它具有重要的经济价值。大针茅常与其他牧草如中华针茅（Leymus chinensis）、Michno氏羊茅（Agropyron michnoi）和Cleistogenes squarrosa共同生长，构成了典型草原地区的放牧和干草生产基地。近年来，大针茅及其相关草原生态系统因其在草原形成、生态演替、放牧适应和环境响应中的作用而受到研究者的广泛关注。研究内容涵盖了群落组成和演替机制（Wang等人，2016；Gao等人，2018）；不同放牧强度下的生物量生产、生理和生态特征及基因表达（Ren等人，2012；Wan等人，2015；Yu等人，2020；Dang等人，2021）；放牧对土壤养分、微生物群落和土壤动物的影响（Hu等人，2015；Yang等人，2016）；以及放牧对大针茅草原群落遗传多样性的影响（Peng等人，2015）。此外，还研究了该物种对水分可用性、CO2浓度、温度、降水量和干旱等不同环境因素的生理响应（Xu和Zhou，2011；Xu等人，2014；Song等人，2016；Bao等人，2019；Zhang等人，2019）。最后，还探讨了大针茅在环境变异性背景下的表型可塑性和局部适应（Gao等人，2018）。尽管取得了这些进展，但由于缺乏参考基因组，对大针茅的物种形成、进化历史、分布和适应性机制的深入研究仍受到限制，尤其是在环境胁迫和放牧压力条件下。本研究利用下一代测序、高保真长读长测序和高通量染色体构象捕获技术构建了高质量的大针茅参考基因组，对其进化特征进行了分析，推断出了祖先核型，并明确了其在禾本科亚科中的系统位置。这一基因组资源为大针茅及其相关物种的起源、进化、生物学和栖息地适应研究奠定了基础。此外，通过全转录组测序，我们发现了渗透响应的基因表达模式、关键代谢通路和细胞过程，并探讨了相关的ncRNA调控网络。我们的发现强调了激素信号传导和淀粉/蔗糖代谢在大针茅渗透响应中的作用，为未来的功能研究和机制分析提供了候选基因。

2. 材料与方法
2.1 植物材料
2022年7月底，从中国内蒙古锡林浩特东部（44°08′31′N，116°18′45′E，海拔1129 m）采集了大针茅的叶片（图1a）。用于基因组测序的年轻叶片约20克来自一株生长旺盛的植株，将其置于20 mL的低温管中并迅速低温保存在液氮中。8月底在同一地点采集种子并运送至实验室。在实验室中，选择完全发育的大针茅种子，去除种皮后进行4°C层积处理以诱导发芽。随后用10%次氯酸钠消毒10分钟，并用去离子蒸馏水（ddH2O）多次冲洗。种子播种在15个培养皿（50×19×15 cm；每个培养皿约20粒种子）中，并置于Percival生长箱中在控制条件下培养。30天后，施加聚乙二醇（PEG）胁迫。五个培养皿接受对照处理（CK），其余培养皿分为两组，分别接受15%和30% PEG的Hoagland培养基处理（P15和P30）。六天后，从每个处理组中选取两个培养皿进行叶片和根组织样本的采集。样本迅速在液氮中冷冻，随后转移到-80°C冷冻柜中进行生理评估和转录组测序。其余样本用于性状分析。

2.2 染色体核型和流式细胞术分析
大针茅种子在常温（15°C–25°C）条件下发芽。当根长达到1.5–2.0 cm时，收集根尖并进行2.5小时的一氧化二氮处理，随后用冰醋酸处理5分钟，最后储存在-20°C的75%乙醇中。去除根尖中的剩余乙醇后，用纤维素酶和果胶酶（2:1）混合物在37°C下处理45分钟，并用ddH2O冲洗。样品风干后加入20 μL冰醋酸制备悬浮液。使用Olympus CX23显微镜（Olympus Corporation，东京，日本）筛选分散良好的中期染色体。用21-bp重复序列（AGGGTTT）3（Luo等人，2017）探针检测染色体末端，并在含有样品的载玻片上进行杂交。预处理完成后，将10 μL杂交溶液（含1.5 μL探针和8.5 μL 2× SSC及1× TE混合物）施加到样品上，然后在37°C下孵育2小时。去除非特异性结合的探针后，小心移除盖玻片。接着加入10 μL 4,6-二氨基-2-phenylindole（DAPI）染色溶液，对风干的染色体进行染色。使用配备Photometric SenSys Olympus DP70 CCD相机的Olympus BX63荧光显微镜观察和成像。同时，将0.5 cm2的新鲜大针茅幼叶放入培养皿中，加入400 μL裂解缓冲液后用刀片破碎样品。随后加入1600 μL碘化丙啶（PI）染色溶液（含染色缓冲液、PI和RNase储存液），在黑暗条件下温室中孵育30–60分钟。使用Sysmex CyFlow? Cube6流式细胞仪分析大针茅的基因组大小。**DNA提取、文库构建和基因组测序**

从S. grandis的叶子中采用CTAB方法（Li等人，2013年）提取了基因组DNA。使用NanoDrop-8000系统（Thermo Fisher Scientific，美国特拉华州威尔明顿）和Qubit 3.0荧光计（Life Technologies）评估了提取的DNA质量。DNA样品通过Covaris系统进行处理；随后进行了滚环扩增以生成DNA纳米球。接着，使用DNBSEQ?平台（Servant等人，2015年）构建了无需PCR的文库，并在DNBseq平台上进行了测序。对于HiFi测序，基因组DNA样品通过Megaluptor进行片段化，使用SageELF分离出13-16 kb的片段。随后将接头连接到片段两端，构建了SMRTbell文库。该文库使用PacBio Sequel II系统上的Circular Consensus Sequencing（CCS）模式进行测序。对于Hi-C测序，经过质量检测的DNA样品经过了一系列处理，包括多甲醛交联、MboI酶消化、末端修复、生物素标记、DNA纯化以及捕获处理。最后，在DNBseq平台上进行了配对末端测序。

**2.4. 基因组大小估计**

使用SOAPnuke-v2.1.04（Chen等人，2018年）软件对DNBseq数据进行质量控制，参数设置为：(-n 0.02 -l 20 -q 0.4 -i -G 2 --polyX 50 -Q 2 -seqType 0)，以获得清洁的数据。然后使用GenomeScope（v2.0）（Vurture等人，2017年）和Jellyfish（v2.2.10）（Mar?ais和Kingsford，2011年）根据默认参数评估了S. grandis的基因组大小和杂合性。

**2.5. RNA提取、文库构建和全长转录组测序**

使用RNAiso Plus（TRIzol，Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）从所有室内培养的S. grandis幼苗中提取总RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA的浓度和完整性。随后使用Oligo(dT)富集poly(A) mRNA，并使用SMARTer PCR cDNA合成试剂盒将其逆转录成cDNA。经过BluePippin片段化后，富集长度超过4 kb的cDNA片段并进行PCR扩增。全长cDNA经过损伤修复和末端修复处理，然后添加SMRT哑铃形接头以构建长度超过4 kb的混合文库。最后，使用PacBio UMI ISO-Seq平台进行全长转录组测序。

**2.6. 基因组组装和质量评估**

使用SMRT Link（v11.0）和Soapnuke v2.1.0分别对HiFi和Hi-C测序数据进行了质量控制。过滤后的HiFi CCS数据通过Samtools（v1.1823）（Li等人，2009年）转换为fastp格式。此外，使用PacBio Circular Consensus Sequencing（pbccs）流程在默认参数下对PacBio原始子读取进行过滤和校正。使用Hifiasm软件（版本0.16.1）对得到的PacBio测序数据进行从头组装，以构建contig级别的基因组。将Hi-C清洁数据使用Juicer（版本1.5）（Durand等人，2016年）与BWA对齐，并根据Hi-C读取结果进行筛选，去除不匹配的读段。根据Hi-C读段，使用3D de novo组装（3D DNA）和Juicer（版本1.5）工具对组装的contigs进行聚类和定向，得到scaffold级别的基因组和染色体级别的基因组。基于Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs（BUSCO）（版本3.0.2）（Manni等人，2021年）和长末端重复序列（LTR）组装指数（LAI）评估基因组的完整性，LAI指数使用LTR_retriever计算得出。

**2.7. 基因组注释**

使用基于同源性和从头测序的方法对S. grandis基因组中的重复序列进行注释（Price等人，2005年）。基于RepBase v21.12（Bao等人，2015年）库，使用RepeatMasker（v4.0.7）（Tarailo-Graovac和Chen，2009年）和RepeatProteinMask（v4.0.7）（Partridge等人，2018年）（http://www.repeatmasker.org/）识别同源重复序列。通过RepeatModeler（Flynn等人，2020年）和LTRharvest（Ellinghaus等人，2008年）进行自我比对，建立从头重复序列文库，然后使用RepeatMasker（v4.0.7）进行重复序列预测。使用LTR_retriever（Ou和Jiang，2018年）编录S. grandis基因组中的LTR逆转录转座子（LTR-RTs）并估计其插入时间线。使用TEsorter（v1.4.6）（Zhang等人，2022b）对LTR-RTs的亚家族进行分类。使用IQTREE（v1.6.11）（Nguyen等人，2015年）识别最具代表性的LTR-RT元件，特别是Ty3/Gypsy和Ty1/Copia逆转录转座子，并分别使用MAFFT（v7.505）（Katoh和Toh，2008年）和trimAl（v1.4.rev15）（Capella-Gutiérrez等人，2009年）进行比对和修剪。利用IQTREE构建每个LTR-RT家族的最大似然（ML）树，使用RAxML（v8.2.12，Stamatakis，2014年）和1000次自举复制。使用iTOL（v6）（Letunic和Bork，2007年）可视化系统发育树。对于基因结构预测，使用HISAT（v2.2.1）（Kim等人，2019年）和Gmap软件将RNA-seq数据和全长转录组数据与基因组对齐。使用GeMoMa（v1.9）（Keilwagen等人，2016年）提取所有样品的内含子信息，以便后续注释。同时，使用TransDecoder从转录组数据中预测开放阅读框（ORFs），基于转录组测序数据得到基因注释结果，进而整合特定于转录组的基因。基于五个参考物种（Brachypodium distachyon、Hordeum vulgare、Zea mays、Oryza sativa和Vitis vinifera）使用GeMoMa进行基因结构预测和信息整合。使用BUSCO v5.2.2评估基因集的完整性，并将蛋白质集与embryophyta_odb10数据库进行比较，以评估预测的完整BUSCO基因的数量和比例。最后，使用Diamond（v0.8.3630）（Buchfink等人，2021年）将预测基因与SwissProt（Boeckmann等人，2003年）、TrEMBL（Junker等人，2000年）、KEGG（Ogata等人，1999年）、InterPro（Zdobnov和Apweiler，2001年）、NR（Koonin等人，2004年）、KOG（O'Leary等人，2016年）和GO（Ashburner等人，2000年）等数据库中的已知蛋白质进行功能注释。

**2.8. 系统发育分析和分歧时间估计**

使用Orthofinder（版本2.5.5）（Emms和Kelly，2019年）对S. grandis、V. vinifera、O. sativa、Aegilops tauschii、H. vulgare、B. distachyon、Achnatherum splendens、Z. mays和Raddia guianensis的基因组进行同源基因聚类分析。总共获得了9个物种的188个高质量单拷贝正交群，用于构建系统发育树。使用MUSCLE（v3.8.31）（Edgar，2004年）进行多重序列比对，并根据比对结果将蛋白质序列转换为编码DNA序列（CDS）。使用Gblocks（版本0.91b）过滤、对齐保守区域并去除序列中的空缺。使用IQ-TREE（版本1.6.11）中的ModelFinder获得最优模型，随后构建系统发育树。最终的系统发育树使用RAxML（版本8.2.12）和最优模型JTT+F+R3以及1000次自举复制构建。为了估计物种分歧时间，使用PAML（版本4.9h）（Yang，2007年）包中的MCMCtree模块。树的根年龄根据V. vinifera和Z. mays设定（置信区间：142.1–163.5 Mya）（http://www.timetree.org），并根据植硅体数据确定Oryzoideae（66 Mya）和Pooideae（40 Mya）的化石时间（Zhang等人，2024年）。使用tvBOT可视化生成的系统发育树。此外，使用WGDI软件（Sun等人，2022年）从S. grandis、V. vinifera、O. sativa、A. tauschii、H. vulgare、B. distachyon、A. splendens、Z. mays和R. guianensis的基因组中提取共线性基因，用于系统发育分析。

**2.9. 基因重复、基因家族扩张和收缩**

使用Orthofinder v2.5.5和参数‘-M msa’以及STRIDE方法，通过复制-丢失-聚合（DLC）模型识别基因重复事件（GDEs）。使用Computational Analysis of gene Family Evolution（CAFE）版本5.0软件（De Bie等人，2006年）的默认参数进行基因家族扩张和收缩分析。此外，使用OmicShare平台提供的在线工具（https://www.omicshare.com/tools/）（Mu等人，2024年）对支持率超过50%的重复基因以及基因家族扩张和收缩进行GO和KEGG富集分析。

**2.10. 全基因组重复事件的识别**

为了检测WGD事件，对S. grandis、V. vinifera、O. sativa、A. tauschii、H. vulgare、B. distachyon、A. splendens和Z. mays的基因组进行了基因组内和基因组间的同线性分析。首先使用TBtools提供的插件处理参考基因组序列和GFF文件。然后使用Diamond（版本2.1.6-1）进行BLAST比对，E值阈值设为≤1e-5，并将结果保存为fmt6.blast文件。在默认参数下依次执行WGDI命令-d、-icl、-ks、-bi、-bk、-c和-kp，以识别每个物种内的同线性块。随后使用WGDI -pf程序估算Ks峰值，并使用公式T = Ks/2r计算WGD和物种形成事件的时间，其中r表示每个位点的年同义替换率。r根据ρ-WGD事件的时间（98.2 Mya）（Ma等人，2021年）推导得出。此外，使用-kf命令可视化基因组内和基因组间的同线性基因的中值Ks值。最后，使用TBtools中的one-step MCScanX、File Merge For MCScanX和multiple synteny plot插件分析并可视化同线性核型。

**2.11. 祖先核型的重建和核型进化轨迹分析**

使用S. grandis基因组，对Pooideae亚科的祖先核型进行了系统发育分析，并绘制了其在亚科内的进化轨迹。首先识别S. grandis中的WGD事件，然后重建祖先核型；最后通过与密切相关的物种进行比较映射验证和校正祖先核型的准确性（详细方法见补充材料）。为了分析Stipeae族内物种的核型进化，选择了Poaceae科的八个物种。遵循类似于O. sativa基因组的流程（相当于AGK），使用WGDI和参数-d、-icl、-bi、-c、-km和-d进行核型映射。

**2.12. 全长转录组测序的RNA制备**

使用改良的CTAB方法（Porebski等人，1997年）从18个样本（叶子和根，每个处理三次生物学重复）中提取总RNA。组织在预热的CTAB缓冲液（含2% β-mercaptoethanol）中均质化，65°C孵育15分钟，然后冷却至室温。将匀浆液在12,000 ×g和4°C下离心5分钟。将上清液转移到1.5 mL试管中，与1/5体积的氯仿:异戊醇（24:1）混合，然后在相同的条件下再次在12,000 ×g和4°C下离心10分钟。收集水相，与等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）混合，再次在相同条件下离心。将上清液与等体积异丙醇混合，在-20°C下孵育2小时以沉淀RNA。RNA沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤并溶解在无RNase水中。使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州）评估RNA的完整性。

**2.13. 文库构建、测序和lncRNA及mRNA分析**

使用BGI Optimal Dual-Module mRNA Library Kit（BGI，中国深圳）构建文库。总RNA（2 μg）用DNase I处理，并使用TIANSeq rRNA Depletion Kit（TIANGEN，北京，中国）去除rRNA。随后将RNA随机片段化为200 nt的片段，并使用随机引物逆转录成第一链cDNA。接着添加DNA聚合酶I、反应缓冲液、dNTPs和RNase H进行第二链cDNA合成。后续步骤包括末端修复、腺苷化、接头连接和PCR扩增。PCR产物被变性后， circular化成单链DNA，并通过phi29介导的滚环扩增技术扩增为DNA纳米球（DNBs）。在BGISEQ-500平台上进行了双端（100 bp，PE100）测序。原始测序数据通过SOAPnuke过滤，以去除含有接头的读取序列、低质量碱基超过20%（质量得分≤15）的读取序列以及含有超过5%模糊核苷酸（“N”）的读取序列。每个样本的清洁读取序列使用HISAT2与S. grandis基因组对齐，然后使用StringTie进行转录本组装，并通过Cuffmerge将不同样本的组装结果合并。使用getorf、LongOrfs和txCdsPredict预测CDSs，随后将其翻译成肽序列。转录本的编码潜力通过CPC2（Kong等人，2007年）、LGC和CNCI（Sun等人，2013年）进行评估，并通过Pfam（Mistry等人，2021年）和SwissProt数据库进行同源性搜索，以区分mRNA和lncRNA。清洁读取序列使用Bowtie2（Langmead和Salzberg，2012年）重新对齐到参考序列，基因表达水平使用RSEM（Li和Dewey，2011年）进行量化。为了预测顺式调控关系，将位于每个lncRNA基因组上下游10 kb范围内的mRNAs指定为其潜在的顺式调控靶标。通过计算lncRNAs和mRNAs的表达水平之间的Spearman和Pearson相关系数来推断互作关系。相关系数≥0.6的配对被认为指示了潜在的顺式调控关系。

2.14. 小RNA文库构建、测序和分析
使用MGIEasy Small RNA Library Kit（BGI，深圳，中国）构建了小RNA测序文库。总RNA（2 μg）经过顺序3'和5'接头连接、逆转录和PCR扩增。PCR产物被变性后， circular化成单链DNA，并通过phi29介导的滚环扩增技术扩增为DNA纳米球（DNBs）。最后，在BGISEQ-G400平台（BGI，深圳，中国）上进行测序，获得了单端50 bp（SE50）的读取序列。原始测序数据通过去除低质量标签、含有5'引物污染物的标签、多聚腺苷酸化（poly A）标签、长度小于15 nt的标签以及缺乏3'引物或插入序列的标签进行过滤。清洁读取序列使用Bowtie2（v2.2.9）（Langmead等人，2009年）与S. grandis基因组对齐，用于miRNA预测。已知的miRNAs通过将读取序列与miRBase、RNAcentral V16.0和Rfam数据库使用cmsearch（Nawrocki和Eddy，2013年）进行比对进行注释。新的miRNAs使用miRDeep-P2（Kuang等人，2019年）进行预测。然后，使用psRobot（Bonnet等人，2010年）和TargetFinder（Fahlgren和Carrington，2010年）识别miRNAs的目标基因。这两种软件均使用各自的默认参数运行（psRobot：-ts 4 -fp 2 -tp 17 -gl 17 -p 8 -gn 1；TargetFinder：-c 4）进行分析。两种工具识别结果的交集被视为高置信度的靶向关系。最后，通过计数整合到cDNA分子中的独特分子标识符（UMIs）来量化miRNAs。表达水平计算如下：表达水平 = (C ×1,000,000)/T，其中C表示映射到特定小RNA的UMI计数，T表示样本中清洁读取序列的总UMI计数。

2.15. 差异表达分析和互作网络构建
清洁读取序列使用Bowtie2与S. grandis基因组对齐，基因表达使用RSEM和TPM（每百万转录本）标准化进行量化。差异表达分析使用DESeq2（v1.34.0）进行。基于变化倍数（FC）≥2.0、Q值≤0.05和FDR≤0.01的标准识别差异表达的mRNAs。同时，使用FC≥1.5和P值≤0.05的阈值识别差异表达的miRNAs和lncRNAs。在S. grandis叶片和根部受到渗透胁迫时，对mRNAs和lncRNAs的差异表达进行互作分析。建立成对的互作关系，并构建了一个竞争性内源性RNA网络。最后，使用Cytoscape（v3.10.0）可视化该网络。

2.16. 基因表达谱的实验验证
进行了实验验证，以检测16个基因和14个非编码RNA的表达水平和互作关系。在这些实验中，Actin-7（gmmChr02G012600.2）（Dang等人，2021年）和Elongation factor 1-beta（STRG.22099.1.p1）（Wan等人，2017年）分别作为mRNA和lncRNA的内部参考，U6（chr10_37412142_37412239_+）（Belli Kullan等人，2015年）作为miRNA的内部参考。引物使用NCBI Primer-BLAST程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计，并由Tsingke Biotechnology Co., Ltd.（北京，中国）合成（引物序列在补充方法中提供）。RNA样本与用于干旱胁迫转录组测序的样本相同。值得注意的是，mRNA使用PrimeScript? RT Reagent Kit（RR047A，Takara Biomedical Technology，北京，中国）逆转录成cDNA，而miRNA cDNA使用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（AG11717，Accurate Biology，北京，中国）合成。反应体系使用PerfectStart? Green qPCR SuperMix（AQ601-01-V2，TransGen Biotech，北京，中国）准备，并在QIAquant 96 5Plex平台（QIAGEN，Germantown，MD，美国）上进行qRT-PCR。反应体系和程序详细信息在补充方法中。每个实验包括三个生物学重复和三个技术重复，表达水平使用2?ΔΔCt方法计算。组间显著差异（P < 0.05）通过单因素方差分析（ANOVA）确定。

2.17. 生理和代谢检测
为了评估S. grandis对PEG诱导的渗透胁迫的生理反应，在对照和处理样本中测量了一系列生理指标。这些指标包括：吲哚-3-乙酸（IAA）和脱落酸（ABA）的含量（使用高效液相色谱法HPLC测定）；关键碳代谢酶的活性，包括蔗糖磷酸合成酶（SPS）、淀粉分支酶（SBE）、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）、果糖-1,6-二磷酸酶（FBP）和磷酸甘油酸激酶（PGK）；以及抗氧化系统酶的活性，即超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和硫氧还蛋白还原酶（TrxR）。所有酶活性均使用Comin Biotechnology（苏州，中国）提供的商业试剂盒测定，每个样本进行五次生物学重复。数据以平均值±标准误差（SE）表示。通过ANOVA评估处理组间差异的统计显著性（P < 0.05）。

2.18. 双荧光素酶检测
为了验证miRNA与其目标基因之间的互作，进行了双荧光素酶报告基因检测。简要地说，候选目标基因（gmmChr08G000150.1和gmmChr04G015330.1）及其互作miRNAs（novel-miRNA-7-3p和novel-miRNA-141-3p）分别克隆到22OV43载体和pGreenⅡ62-SK载体中。重组载体通过MicroPulser 1652100（BIO-RAD）电穿孔引入Agrobacterium tumefaciens菌株GV3101-P19中。选择阳性克隆并在含有卡那霉素和利福平的LB培养基中培养，直到600 nm处的光密度（OD600）达到0.8–1.0。将从共转化菌株中提取的细菌细胞等体积混合，以5000 rpm离心10分钟，然后重新悬浮在等体积的浸润缓冲液中（10 mM MgCl2、10 mM MES、150 μM acetosyringone，pH 5.6）。在室温下静置2–3小时后，将悬浮液浸润到Nicotiana benthamiana植物的叶片中。浸润后的植物生长72小时后，注入1× D-荧光素（Biotium）。使用Tanon 5200荧光成像系统捕获荧光信号。烟草植物在控制条件下培养4–5周：16小时光照/8小时黑暗的光周期、25 °C和70%的相对湿度。

3. 结果
3.1. 染色体核型和基因组大小估计
染色体核型分析显示S. grandis共有44条染色体，证实它是一个二倍体物种（2n = 2x = 44）（图S1）。流式细胞术分析表明S. grandis的基因组大小约为1.124 Gb（图S2，表S1）。通过DNBseq平台上的NGS共生成了250.41 Gb的清洁数据。基于21-mer频率估计的基因组调查显示S. grandis的基因组大小为1.103 Gb，杂合率为0.42%，重复序列含量为52.45%（图S3，表S2）。

3.2. 基因组测序和组装
HiFi和Hi-C测序分别生成了103.7 Gb和255.9 Gb的清洁数据（表S3）。HiFi数据组装产生了1.318 Gb的contig级基因组，contig N50值为24.352 Mb（表1）。然后，使用过滤后的Hi-C接触将组装的contigs聚类、排序并定向到染色体上。最终，contigs被锚定到22条染色体上，总长度为1.152 Gb，scaffold N50为50.734 Mb（图1，表1，图S4和表S4）。值得注意的是，contig级和染色体级基因组的BUSCO完整性均为98.0%（1614个中的1582个）（表1，表S5）。组装基因组的LAI得分为27.01（图S5），表明其为高质量组装。

表1. S. grandis基因组组装的特征
类别 参数 数量/大小
组装 轴测序估计的基因组大小（Gb） 1.103
contigs的总长度（Gb） 1.318
contigs的数量 193
N50 contig长度（bp） 24,017,217
GC比率（%） 0.47
完整BUSCO的百分比 98.0
scaffolds的总长度（Gb） 1.104
scaffolds的数量 24
N50 scaffold长度（bp） 50,734,076
GC比率（%） 0.47
锚定到染色体的scaffolds的百分比 98.0
scaffolds的长度（Gb） 1.152
注释
重复序列的长度（Mb） 548.64
蛋白质编码基因的数量 43,803
完整BUSCO的百分比 98.2
基因的平均长度（bp） 4,402.23
每个基因的平均外显子数（N） 5.11
注释基因的数量 42,657
非编码RNA的数量 15,676

3.3. 基因组注释
在S. grandis基因组中鉴定出大约588.72 Mb的重复序列（图1，表S6）。其中，LTR（485.67 Mb）最为丰富，占基因组的41.43%，其次是DNA转座子（96.21 Mb，8.21%）和长分散核元件（LINEs）（23.53 Mb，2.01%）。同时，其他类型的重复序列占这些序列的比例较小（表S6）。在S. grandis基因组中预测出43,803个蛋白质编码基因，平均基因长度为4,402.23 bp（表1）。BUSCO分析显示，98.2%的注释基因可以被分类为完整BUSCOs（表S7）。在预测的基因中，42,657个（97.38%）存在于七个公共数据库中，具体为Nr（97.15%）、KEGG（71.75%）、KEGG（71.92%）、GO（59.12%）、SwissProt（77.59%）和Interpro（92.53%）（表S8，图S6）。此外，还鉴定出15,676个ncRNAs，包括4,976个rRNAs、202个miRNAs、903个snRNAs和1,639个tRNAs（表S9）。

3.4. WGD事件的鉴定
同线性分析显示S. grandis基因组存在347个同源区域，由25,113对同源基因对组成。S. grandis基因组中的同源区域相对完整，尽管观察到了少量的融合-断裂事件（图2a）。S. grandis基因组中的大多数同源区域显示出1:1的关系（图2a中的红色方框中的红点），而一些显示出1:2的关系（图2a中的蓝色方框中的绿点），表明该物种经历了不同的多倍化事件。在研究的不同Poaceae物种中，S. grandis和A. splendens具有最多的同源基因对和最完整的同源区域（图S7），这表明这两种物种的基因组具有相似的进化历史。

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图2. S. grandis基因组的基因组进化分析。(a) S. grandis基因组的同线性块点图。(b) S. grandis与B. distachyon基因组之间代表性同线性块的点图。(c) S. grandis与O. sativa基因组之间代表性同线性块的点图。(d) 分析基因组的同源基因的种内和种间Ks密度。(e) 分析基因组的LTR-RT插入时间估计。(f) S. grandis基因组中Ty3/Gypsy可移动元件的聚类分析。(g) S. grandis基因组中Ty1/Copia可移动元件的聚类分析。
对O. sativa和S. grandis基因组的比较分析显示，同线性主要表现为1:2的关系（图2c，图S8）。值得注意的是，O. sativa的2号染色体与S. grandis的12号和15号染色体具有强烈的同源性，每个直系同源区域对应于水稻的4号和6号染色体上的旁系同源基因。这表明在ρ事件之后，S. grandis经历了额外的WGD事件。B. distachyon和S. grandis之间的同源关系与O. sativa相似，支持S. grandis经历了额外的WGD事件（图2b）。O. sativa、B. distachyon、S. grandis和A. splendens的旁系同源基因的Ks峰值大约为0.7?0.8，对应于Poaceae家族中共同的ρ事件（约98.2 Mya）（图2d）。对于A. splendens和S. grandis的旁系同源基因，额外的Ks峰值大约为0.17，对应于S. grandis和A. splendens之间的共同WGD事件。根据校准后的ρ-WGD时间，该事件被认为发生在约2100万至2500万年前（图2d）。O. sativa和B. distachyon与S. grandis的同源物的Ks峰值分别为约0.4和0.3，估计它们的分化时间分别约为6400万年和4000万年（图2d）。LTR-RT插入时间的分析显示，在Pooideae亚科的物种基因组中，特别是在S. grandis、O. sativa和Z. mays中，近期发生了LTR爆发（< 0.3百万年）（图2e）。Ale和Retand是S. grandis中Ty1/copia和Ty3/gypsy家族中主要的LTR-RTs，它们被认为是这些物种基因组进化的重要驱动因素。为了阐明S. grandis基因组的进化轨迹，我们基于S. grandis、O. sativa和A. splendens的基因组重建了Pooideae亚科的祖先核型（补充方法）。同线性分析表明，O. sativa的1-12号染色体在S. grandis中得到了保留（图3a）。在A. splendens基因组中，可以找到O. sativa的Chr10的完整对应染色体（图3b）。与O. sativa相比，S. grandis缺失了一部分Chr7的拷贝，而在A. splendens中，Chr3、Chr4、Chr5、Chr8和Chr11的部分拷贝丢失（图3a和3b中的绿色区块）。在O. sativa和R. guianensis之间，观察到O. sativa的Chr2、Chr7、Chr9和Chr11在R. guianensis中有显著的结构变化（图3c）。这些结果表明，R. guianensis的染色体变化是在其分化后特有的，而O. sativa的完整染色体在S. grandis和A. splendens中得到了保留，这些染色体是从Pooideae祖先那里继承来的。例如，S. grandis的Chr20与O. sativa的Chr3是同源的。由于ρ事件后的染色体融合，它还与O. sativa的Chr7和Chr10（旁系同源物）表现出同线性（图3a）。这些分析表明，重建的祖先核型与O. sativa基因组相同，代表了禾本科（Poaceae）或草类的祖先核型（AGK）。

为了追踪Pooideae亚科的染色体重排历史，我们以O. sativa作为参考，推断其进化轨迹（图3d）。从祖先染色体开始，R. guianensis经历了三次 reciprocal chromosomal translocation（RCT）事件和一次 nested chromosome fusion（NCF）事件，形成了其11条染色体（图3f）；B. distachyon通过七次NCF事件演化出了五条染色体（图3i）；H. vulgare和A. tauschii在四次NCF事件、一次RCT事件和一次end-to-end joining（EEJ）事件后形成了七条染色体（图3h）。在Stipeae族的进化过程中，P-WGD事件之后，post-P AGK9和post-P AGK3染色体通过RCT事件形成了Sg11/As7和Sg4/As19，而post-P AGK10和post-P AGK11通过EEJ事件形成了Sg1（图3d）。这些重排事件定义了Stipeae族共享的23条染色体的过渡祖先核型。在这些变化之后，S. grandis和A. splendens发生了分离，它们的染色体结构各自独立变化（图3d）。具体来说，A. splendens通过五次RCT事件和三次EEJ事件演化出了24条染色体（图3g），而S. grandis通过三次RCT事件、一次NCF事件和一次EEJ事件演化出了22条染色体（图3e）。

我们对比分析了Pooideae、Bambusoideae、Panicoideae和Oryzoideae亚科以及Vitaceae科的代表性物种的基因组。总共识别出358,149个同源基因，其中90.7%（324,683个基因）被分入30,805个正交群。在这些正交群中，8,088个是物种特异性的，9,127个被九个物种共享，118个是S. grandis基因组特有的（图4b）。基于识别出的188个高质量单拷贝正交群，构建了一棵ML树来分析这些物种之间的系统发育关系（图4a）。在八个禾本科物种中，R. guianensis首先从O. sativa分化出来，然后是Pooideae分支。随后，Stipeae族（S. grandis和A. splendens）发生了分离（图4a）。

基于化石校准，我们估计O. sativa和R. guianensis的分化时间约为6589万年前，而B. distachyon与其他两个物种A. tauschii和H. vulgare的分化时间约为3167万年前（图4a）。此外，我们从八个禾本科物种中提取了同源基因，构建了一个以O. sativa Chr04为根的基因合并树（图S9）。所得物种树的拓扑结构与基于单拷贝同源基因构建的系统发育树一致，验证了Stipeae族，特别是S. grandis和A. splendens所经历的Pooideae特异性WGD（P-WGD）事件。

GDE分析显示，在上述系统发育关系下，节点N1和N5（支持率≥50%）相关的GDEs比其他节点更多（图4c和4d，表S10）。这与之前的WGD分析一致，即节点N1和N5的时间分别对应于禾本科的ρ-WGD事件和Stipeae族的谱系特异性WGD事件。CAFE分析在节点N1、N5和S. grandis分别识别出500、3092和3376个扩增的基因家族。GO富集分析表明，节点N1和N5在“结构分子活性”和“抗氧化活性”类别中显著富集（图4e和4g，表S11-S14）。S. grandis分支在“抗氧化活性”、“结构分子活性”和“电子转移活性”类别中显示出显著富集（表S15和S16）。KEGG富集分析显示，节点N1主要富集在苯丙烷类生物合成、淀粉和蔗糖代谢以及半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等代谢途径中。节点N5的基因在植物-病原体相互作用、植物激素信号传导和MAPK信号通路中显著富集（图4f和4h，表S17-S20）。S. grandis分支的基因主要富集在苯丙烷类生物合成、光合作用和各种次级代谢产物的生物合成中（表S21和S22）。

在不同渗透压胁迫强度下，几种生理指标发生了显著变化。在叶片中，ABA的浓度以及POD、SOD和PGD等酶的活性随着胁迫强度的增加而显著增加。同样，在根部，包括POD、SPS、SBE和PGD在内的酶的活性也显著增加（图5a）。形态变化也很明显。特别是在P30条件下，叶片严重萎蔫，根毛数量显著增加（图5b和5c）。

为了阐明这些表型变化背后的基因表达和调控机制，我们在不同渗透压胁迫条件下对S. grandis进行了全转录组测序。总共从18个lncRNA文库中生成了198.81 Gb的纯净数据（表S23），平均每个样本约11 Gb，基因组比对率为92.48%（表S24）。同时，小RNA文库每个样本产生了1990万至2427万个纯净读段（表S25），其中超过90%的读段是纯净的，基因组比对率在75.96%到94.63%之间（表S26）。在lncRNA文库中，识别出53,124个mRNA和6,501个lncRNA。其中，24,749个mRNA和3,342个lncRNA在生物重复实验中表现出高重复性（变异系数CV ≤0.6），并被保留用于差异表达分析。在小RNA文库中，识别出474个新的miRNA（表S27）。在叶子和根部的样本对比中，分别识别出744个和2,238个差异表达的mRNA（DEmRNAs）（表S28和S29），以及811个和1,433个差异表达的lncRNA（DElncRNAs）（表S30和S31）。在DEmRNAs中，597个、336个和366个分别来自节点N1、N5和S. grandis。在叶子中，CKL与P30L的对比产生了最多的DEmRNAs（609个）和DElncRNAs（154个），其次是P15L与P30L（261个DEmRNAs，111个DElncRNAs）和CKL与P15L（111个DEmRNAs，80个DElncRNAs）。在根部，CKR与P15R和CKR与P30R的对比产生了更多的DEmRNAs（1,492个和1,394个）和DElncRNAs（979个和961个）。

如图5d所示，DEmRNAs和DElncRNAs在不同处理组之间的重叠较少，反映了S. grandis在不同渗透压强度下采用的不同的转录策略。叶子中的DEmRNAs和DElncRNAs数量较少，表明叶子组织对PEG处理的转录响应延迟。相反，根部在渗透压胁迫下表现出敏感的转录重编程。因此，在P15R与CKR和P30R的对比中检测到大量的DEmRNAs和DElncRNAs。miRNA文库中，在叶片和根部分别识别出390个和352个渗透压响应性miRNA（DEmiRNAs）（图5e，表S32和S33）。在根部，下调的DEmiRNAs占多数，表明S. grandis主要采用miRNA抑制作为应对渗透压的策略。值得注意的是，在L15R_VS_CKL和P15R_VS_CKR的比较中，DEmiRNA的数量最高，这反映了miRNA对渗透压应激的敏感性。叶片和根部之间DEmiRNA的有限重叠表明，在不同程度的PEG处理下，S. grandis的调节景观具有组织特异性。3.9. 在渗透压应激反应中关键基因调控模块的鉴定基于目标基因预测，发现S. grandis的DElncRNAs分别与562个和24个DEmiRNAs相互作用，同时有6个DElncRNAs共同调控了18个DEmiRNAs（见表S34）。在不同PEG强度下，叶片和根部的DEmRNAs、DElncRNAs和DEmiRNAs表现出不同的表达模式，分别聚类成8个、4个和6个共表达模块（见图5f和5g）。总体而言，DEmRNAs与其相互作用的ncRNAs相比，表现出一致或相反的表达趋势：DEmRNA-DElncRNA对中的共上调/共下调占多数，而DEmRNA-DEmiRNA对中的负相关更为常见（见表S35）。共有37个miRNAs、36个lncRNAs和21个DEmRNAs形成了多层次的相互作用网络。其中，18个DEmiRNAs和6个DElncRNAs通过36个相互作用模块共同调控了6个DEmRNAs（见表S36和S37）。有趣的是，与ncRNAs相互作用的DEmRNAs在GO术语（如响应刺激、催化活性和转录调节活性）以及KEGG通路（如淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号传导和MAPK信号通路）中显著富集（见表S38?S43）。这些发现突显了ncRNA介导的调节网络在S. grandis中的关键作用，尤其是在调节代谢重编程和应激信号级联中的作用。3.10. 激素信号网络和渗透压响应基因调控在S. grandis基因组中，共有1,017个mRNAs、215个lncRNAs和43个miRNAs被注释为激素信号传导通路（见图6a和6b）。调控网络分析显示，在渗透压应激下，S. grandis的激素信号传导通路形成了一个相互作用网络。在这个网络中，BR和IAA通路尤为突出，包含了最广泛的基因表达相互作用关系，可能是该物种对渗透压应激的调控枢纽（见图6b）。此外，在ρ-WGD事件期间，ABA、IAA和BR通路显著扩展（N1节点），而SA通路在S. grandis中繁荣发展（见图6a中的面积图）。差异表达的转录本（DEmRNAs/DElncRNAs/DEmiRNAs）分布在这些通路中，分别为：生长素（15/25/4）、油菜素内酯（BR；15/17/12）、ABA（18/18/0）、乙烯（7/7/1）、赤霉素（GA；7/11/5）、水杨酸（17/6/0）和茉莉酸（JA；5/7/1）（见图6a，表S44?S46）。在渗透压应激条件下，与激素相关的基因家族表现出组织特异性表达模式（见图6c）。在ABA通路中，ABF基因gmmChr04G004920.1在P30根部的表达比CK根部高2.69倍，而PP2C基因gmmChr11G007320.1在P30叶片中的表达高2.13倍。在生长素通路中，7个IAA基因在P30根部的表达平均下调了1.59倍，而ARF基因TCONS_00014676在P15根部的表达上调了1.04倍。在乙烯通路中，EIN3基因STRG.36022.1.p1和STRG.18119.1.p1在P30根部的表达高于CK根部（TPM分别为100.12和71.23；上调了1.04和1.02倍）。在JA通路中，JAZ基因gmmChr09G014120.1在P30根部的表达从149.79下降到81.47（log2fc = -1.01）。在GA通路中，GDI1基因STRG.15985.1.p1在P30根部的表达从179.22下降到81.09（log2fc = -1.24），而DELLA基因gmmChr15G005940.1在P30叶片中的表达从43.76上升到101.66（log2fc = 1.02）。值得注意的是，与ncRNAs相互作用的DEmRNAs在响应刺激、催化活性和转录调节活性等GO术语中显著富集，以及在淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号传导和MAPK信号通路等KEGG通路中也是如此（见表S38?S43）。这些发现突显了ncRNA介导的调节网络在S. grandis中的关键作用，特别是在调节代谢重编程和应激信号级联中的作用。3.10. 激素信号网络和渗透压响应基因调控在S. grandis基因组中，共有1,017个mRNAs、215个lncRNAs和43个miRNAs被注释为激素信号传导通路（见图6a和6b）。调控网络分析显示，在渗透压应激下，S. grandis的激素信号传导通路形成了一个相互作用网络。在这个网络中，BR和IAA通路尤为突出，包含了最广泛的基因表达相互作用关系，可能是该物种对渗透压应激的调控枢纽（见图6b）。此外，在ρ-WGD事件期间，ABA、IAA和BR通路显著扩展（N1节点），而SA通路在S. grandis中繁荣发展（见图6a中的面积图）。差异表达的转录本（DEmRNAs/DElncRNAs/DEmiRNAs）分布在这些通路中，分别为：生长素（15/25/4）、油菜素内酯（BR；15/17/12）、ABA（18/18/0）、乙烯（7/7/1）、赤霉素（GA；7/11/5）、水杨酸（17/6/0）和茉莉酸（JA；5/7/1）（见图6a，表S44?S46）。在渗透压应激条件下，与激素相关的基因家族表现出组织特异性表达模式（见图6c）。在ABA通路中，ABF基因gmmChr04G004920.1在P30根部的表达比CK根部高2.69倍，而PP2C基因gmmChr11G007320.1在P30叶片中的表达高2.13倍。在生长素通路中，7个IAA基因在P30根部的表达平均下调了1.59倍，而ARF基因TCONS_00014676在P15根部的表达上调了1.04倍。在乙烯通路中，EIN3基因STRG.36022.1.p1和STRG.18119.1.p1在P30根部的表达高于CK根部（TPM分别为100.12和71.23；上调了1.04和1.02倍）。在JA通路中，JAZ基因gmmChr09G014120.1在P30根部的表达从149.79下降到81.47（log2fc = -1.01）。在GA通路中，GDI1基因STRG.15985.1.p1在P30根部的表达从179.22下降到81.09（log2fc = -1.24），而DELLA基因gmmChr15G005940.1在P30叶片中的表达从43.76上升到101.66（log2fc = 1.02）。值得注意的是，DEmiRNA novel-miRNA-95-3p在P30叶片中的表达从56.64上升到128.38，并与ARF基因gmmChr04G002990.1相互作用。同时，lncRNA TCONS_00074847靶向GH3基因TCONS_00074709，在P15根部的表达从406.3下降到282.04。DEmiRNA novel-miRNA-7-3p在渗透压受胁迫的根部表现出异常高的表达（平均TPM = 3,813.55）（见图6d）。双萤光素酶实验验证了该miRNA直接靶向并抑制BRI1基因（gmmChr08G000150.1）（见图6f）。与此一致的是，对20个BRI1家族成员的序列比对表明，gmmChr08G000150.1的CDS中的三核苷酸缺失可能使其能够与novel-miRNA-7-3p相互作用（见图6e）。有趣的是，这个正交群中的所有基因都是从N1节点衍生出来的重复基因。值得注意的是，两个ARF基因（gmmChr04G002990.1和STRG.5615.1.p1）和四个BRI1基因（gmmChr10G003000.1、gmmChr10G001240.1、gmmChr04G011330.1和gmmChr13G022450.1）与6个lncRNAs和16个miRNAs形成了一个竞争性的内源性RNA（ceRNA）网络。关键相互作用包括DElncRNA TCONS_00062692与DEmiRNAs novel-miRNA-95-3p/novel-miRNA-147-5p（靶向ARF）之间的相互作用，以及DElncRNAs TCONS_00042586/TCONS_00014482与DEmiRNAs novel-miRNA-141/142/175-5p（靶向BRI1）之间的相互作用（见图6b，表S47和S48）。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图6. 在渗透压下Stipa grandis植物激素信号通路的综合分析。（a）关键通路基因和相互作用的非编码RNA鉴定。对于每个通路，条形图（从左到右）分别代表被注释到该通路的mRNAs、lncRNAs和miRNAs；与DEmRNAs相互作用的lncRNAs；与DEmRNAs相互作用的DElncRNAs；与DEmRNAs相互作用的miRNAs；以及DEmiRNAs。面积图表示每个通路基因的来源（N1、N5和S. grandis）。DP表示重复基因。（b）mRNAs、lncRNAs和miRNAs的相互作用网络。用红色数字标记的转录本在渗透压下表达差异。（c）渗透压下关键通路的基因表达模式。热图块代表渗透压下的酶相关DEGs（用星号标记的qRT-PCR验证基因；参见表S49和S50了解对应于热图块的基因）。热图颜色刻度表示基于z分数标准化的Log2倍数变化值。（d）候选基因及其相互作用的ncRNA的qRT-PCR验证结果。X轴代表三种应力处理。左侧Y轴表示mRNA和ncRNA的TPM标准化表达水平（来自RNA-seq数据）。右侧Y轴表示mRNA和ncRNA的相对表达水平（2?ΔΔCt），通过qRT-PCR验证。误差条表示三个生物学重复实验的标准偏差。所有验证结果见图S10。（e）BRI1（gmmChr08G000150.1）及其正交群的系统发育树和多序列比对；比对区域表示novel-miRNA-7-3p的结合位点。（f）使用双萤光素酶实验验证novel-miRNA-7-3p与其目标基因BRI1（gmmChr08G000150.1）之间的相互作用。3.11. 蔗糖和淀粉代谢的渗透压响应调控我们鉴定出了772个编码31种酶的基因，这些酶参与淀粉和蔗糖代谢通路（见图7a）。在基因家族中，AGPase、EG、GA、β-GC和BMY基因家族中的大多数重复基因起源于N1节点，而AMY家族成员是在S. grandis的N节点中发展起来的（见图7a中的面积图）。表达分析显示，99个基因在渗透压下表现出差异表达。这些基因与329个lncRNAs和9个miRNAs相互作用（见图7b和7c，表S51和S52）。大多数基因在P15阶段表达变化较小，但在P30阶段表达显著改变，下调基因略多于上调基因。此外，这些基因大多与淀粉合成和降解相关，反映了S. grandis在响应渗透压挑战时协调的转录变化。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图7. 在渗透压下Stipa grandis的淀粉和蔗糖代谢通路的综合分析。（a）通路相关基因和相互作用的非编码RNA（ncRNA）关系的图形表示。条形图（从左到右）分别代表mRNAs、lncRNAs、miRNAs、DEmRNAs、与DEmRNAs相互作用的lncRNAs、与DEmRNAs相互作用的DElncRNAs、与DEmRNAs相互作用的miRNAs以及与DEmRNAs相互作用的DEmiRNAs。面积图表示每个通路基因的来源（N1、N5和S. grandis）。DP表示重复基因。（b）mRNAs、lncRNAs和miRNAs的相互作用网络。用红色数字标记的转录本在渗透压下表达差异。（c）渗透压下的基因表达模式。热图块代表渗透压下的酶相关DEGs（用星号标记的qRT-PCR验证基因；参见表S54和S55了解对应于热图块的基因）。热图颜色刻度表示基于z分数标准化的Log2倍数变化值。（d）关键基因及其相互作用的ncRNA的qRT-PCR验证结果。X轴代表三种应力处理。左侧Y轴表示RNA-seq数据中的mRNA和ncRNA的TPM标准化表达水平。右侧Y轴表示qRT-PCR验证的mRNA和ncRNA的相对表达水平（2?ΔΔCt）。误差条表示三个生物学重复实验的标准偏差。所有验证结果见图S11。（e）使用双萤光素酶实验验证novel-miRNA-141-3p与其目标基因AGPase（gmmChr04G015330.1）之间的相互作用。几个与蔗糖和淀粉合成相关的基因——包括SPSs、SUs、GBSSs、AGPases、UGPs、SSs和SBEs——随着渗透压强度的增加而上调（见图7c）。相反，参与碳水化合物分解和海藻糖合成的基因（例如INVs、TPPs、β-GCs和GAs）的表达与PEG强度呈负相关（见图7c）。值得注意的是，这些基因在叶片和根部组织中的表达模式是一致的（见图7c）。例如，淀粉代谢相关基因（AGPases、SSs、SBEs和ISAs）通常上调，而葡萄糖合成和海藻糖代谢基因（β-GCs、GAs、EGs和TPPs）则下调（见图7c和7d）。在P30根部，UGPase基因TCONS_00033150的表达从74.62上升到200.66（log2FC = 1.43）。AGPase基因TCONS_00061984和TCONS_00022017在P30叶片和根部分别上调了1.69倍和6.69倍。β-GC基因gmmChr11G017400.1在P30叶片中的表达下调了10.67倍，在P30根部下调了3.64倍。大多数AMY基因在根部组织中下调，尤其是gmmChr05G006570.1的表达从31.83（CK）下降到11.03（log2FC = -1.53）。叶片中的AMY基因gmmChr04G008830.1和gmmChr20G024640.1在P30分别上调了4.90倍和2.16倍，而BMY基因gmmChr01G012730.1在P30根部的表达从8.34（CK）下降到1.68（log2FC = -2.31）。有趣的是，S. grandis中的淀粉和蔗糖通路主要受lncRNAs调控。具体来说，我们鉴定了73个渗透压响应的DE-lncRNAs。例如，与AMY基因gmmChr13G007570.1相互作用的TCONS_00011851在P30根部的表达从229.56下降到90.61。与EG基因TCONS_00057513和β-GC基因TCONS_00055232相互作用的TCONS_00000095在PEG胁迫植物的叶片中表现出高表达（858.80）。尽管BMY基因gmmChr06G00023我们的研究发现表明，S. grandis 含有 43,803 个蛋白质编码基因，这一数量高于 several 代表性的禾本科植物物种，例如 O. sativa（35,594 个）（Jain 等，2019 年）、Z. mays（40,789 个）（Springer 等，2018 年）和 B. distachyon（25,532 个）（Vogel 等，2010 年）。此外，S. grandis 及其近亲 A. splendens（单倍体染色体数：22 对 24；基因组大小：1.12 Gb）具有相对较大的基因组和更多的染色体数目。这些基因组特征可能反映了 Stipeae 族内的复杂进化事件（Xie 等，2024 年），并且可能与物种形成、生态特化以及在干旱和易受放牧影响的环境中发展适应性策略有关。这使得 Stipeae 植物成为探索形成复杂性状（如多年生性和全面抗逆性）的分子机制的理想研究对象。Stipeae 族在其物种中表现出基本的染色体数目（BCN）和基因组大小的显著多样性。在跨越多个属的 120 种 Stipeae 物种中，大约有 26 种是二倍体，其 BCN 分别为 x = 7、8、9、10 或 12（Romaschenko 等，2012 年）。到目前为止，S. grandis 的染色体数目和结构的进化轨迹仍不清楚。在本研究中，我们基于其基因组组装重建了 S. grandis 的祖先核型，将其分为 12 个原型祖先染色体。通过对重建的 Poaceae 祖先核型与 O. sativa 和 R. guianensis 的基因组进行的同线性分析，验证了推断的进化轨迹，这与之前的禾本科基因组进化分析结果一致（Wang 等，2015 年）。我们的推断结果与 O. sativa 的染色体高度相似，进一步证实了水稻基因组可以作为推断相关物种间染色体变化的参考（Murat 等，2010 年；Wang 等，2015 年；Murat 等，2017 年；Tkach 等，2025 年）。此外，我们的分析表明，染色体可塑性——由基因移位、易位和倒位等机制驱动——可能是禾本科家族快速多样化和物种形成的关键驱动力（Li 等，2026 年）。我们的研究结果还支持了 Stipeae 具有 x = 12 的祖先 BCN 的假设（Romaschenko 等，2012 年）。进一步的研究路径分析显示，这些植物的染色体减少主要是由染色体融合事件引起的（Yu 等，2022 年）。这些发现与最近关于禾本科家族早期分支 Pharus latifolius 的研究结论一致，该研究表明，在禾本科祖先基因型分化后，每个主要谱系的基因组都经历了大规模的、谱系特异性的重排（Ma 等，2021 年）。这些事件可能是 Stipeae 族适应复杂栖息地的关键内在驱动力。

基因组倍增（WGD）在植物进化中起着关键作用，驱动基因组大小、结构和功能的大规模改变，从而促进物种多样化和生态适应（Ma 等，2023 年；Meng 等，2023 年；Feng 等，2024 年）。自从被子植物出现以来，禾本科植物至少经历了三次古老的倍增事件（τ、σ 和 ρ）（McKain 等，2016 年；Linder 等，2018 年；Ren 等，2022 年）。在本研究中，同线性分析揭示了 S. grandis 与 A. splendens 和 B. distachyon 之间的 1:2 关系，证实了它们共同经历了独立的 Poaceae 特异性的 WGD 事件（Ren 等，2022 年）。S. grandis 与 O. sativa 之间几乎完全的同线性关系支持了整个禾本科家族中共享的 ρ 事件。ρ 事件之后，O. sativa 的第 4 和第 6 染色体与第 2 染色体之间出现了平行关系。值得注意的是，我们发现 O. sativa 的第 2 染色体与 S. grandis 的第 13 和第 16 染色体具有同源性，每个同源区域进一步与 O. sativa 的第 4 和第 6 染色体存在平行关系。对 S. grandis 和 A. splendens 中共线性基因的 Ks 分析显示双峰分布，也表明它们共同经历了 WGD 事件。第一个峰值（Ks ≈ 0.7–0.8）归因于 B. distachyon、O. sativa 和 R. guianensis 共享的 ρ 事件，而 S. grandis 和 A. splendens 的第二个峰值（Ks ≈ 0.17）可能归因于 Stipeae 植物群体内后续发生的 WGD 事件。S. grandis 的混合进化轨迹使其区别于许多禾本科模型植物（如 O. sativa、B. distachyon 等），为研究倍增如何促进环境适应提供了独特的基因组背景。

在 WGD 事件之后，基因组组成和结构通过染色体重排、基因家族的扩展/收缩以及功能分化等机制不断重塑（Clark 和 Donoghue，2018 年；Almeida-Silva 和 Van de Peer，2023 年；Zhang 等，2024 年）。这些改变导致了物种辐射、适应、多样化和生态位的扩展（Soltis 和 Soltis，2016 年；Van de Peer 等，2017 年）。先前的研究揭示了禾本科中的关键 WGD 事件与主要地质或气候变化之间的相关性。例如，ρ-WGD 促进了植物适应压力响应性状的进化。这一事件可能导致与寒冷、高温、水分、盐分和伤口压力相关的基因家族的保留（Zhang 等，2024 年；Li 等，2025 年；Wang 等，2026 年）以及相关的压力信号通路（Wu 等，2020 年）。在中新世气候最适期（MMCO，约 2000 万年前），Glycine max、Panicum virgatum、Tarenaya hassleriana 和 Z. mays 等物种的谱系特异性 WGD 使它们能够适应较低的二氧化碳水平、盐度、寒冷和干旱以及物理损伤（Koch，2008 年；Zachos 等，2008 年；Schulte 等，2010 年）。根据我们的系统发育分析，N1 和 N5 节点包含了最多的重复基因，对应于上述两次 WGD 事件。在这些节点中的重复基因中，WGD 导致的基因占主导地位。这与分析的禾本科物种之间相对完整的基因组同线性发现一致，反映了 WGD 事件在它们的物种创新和环境适应中的核心作用。许多研究表明，这些基因的出现与当时的地质历史事件高度吻合，这些基因主要富集在许多发育或防御过程中，如抗氧化、转录调控和植物-病原体相互作用，以及包括苯丙烷酸生物合成、碳水化合物代谢和信号传导在内的通路。在这些时期，大陆板块运动和造山活动产生了新的栖息地，并加剧了季节性干旱（Zhang 等，2022a），促进了广泛的物种多样化（例如，在 Triticeae 和 Stipeae 中）。在 Poaceae 亚科中，通过生理特性（如气孔导度调节）和分子适应（如抗氧化酶激活、基因重复/扩增和表达变化）增强了干旱耐受性，促进了物种辐射（Wu 等，2020 年）。对于 Stipa 物种而言，通过 S. grandis 中独特的基因重复和扩增形成了适应干旱的基因组。基因组特征反映了其在进化过程中增强抗氧化能力、能量获取/转换、细胞稳定性以及对环境信号或生物相互作用响应的适应策略（Lerner，2018）。相比之下，A. splendens 中与盐分相关的基因重复副本的增加促进了其适应盐分的基因组（Ren 等，2022）。

S. grandis 的 WGD 和结构变化为其栖息地适应提供了丰富的原材料，为其在复杂环境中的特定应对策略的发展奠定了基础。此外，除了 WGD 事件外，非编码 RNA 的重复进一步复杂化了参与环境适应的表达网络。在植物应激响应的进化过程中，非编码 RNA 系统不断创新，形成了 ceRNA 网络和表观遗传调控系统，共同构成了植物应激适应的协同调控框架，并驱动关键适应性状的形成和可塑性（Li 等，2023 年；Abdulraheem 等，2024 年）。例如，miRNAs 通过抑制目标基因实现快速应激响应，而 LncRNAs 和 circRNAs 作为竞争性内源 RNA，可以隔离 miRNAs，从而缓冲其对目标基因的抑制作用（He 等，2020）。因此，为了进一步研究 S. grandis 对干旱适应的基因组进化机制，我们采用了 PEG 模拟的干旱胁迫来研究其基因表达模式和非编码 RNA 调控系统。正如预期的那样，在不同强度的渗透胁迫下，分别在 S. grandis 的叶片和根部分别鉴定出了 744 和 2,238 个 DeMiRNAs。这些基因表现出多样性和组织特异性表达模式。此外，它们的表达受到广泛的 ncRNAs 网络的调控。总体而言，LncRNAs 和 miRNAs 在根部的调控作用比在叶片中更强。值得注意的是，miRNAs 对渗透胁迫的敏感性高于 LncRNAs。此外，miRNAs 和 LncRNAs 对特定代谢通路表现出优先的调控效应。基于 S. grandis 和 A. splendens 中重复基因和非编码 RNA 目标的功能富集分析，并考虑到渗透胁迫下的形态和生理表型变化，我们重点关注了植物激素信号传导通路和淀粉及蔗糖代谢通路。这使我们能够阐明 S. grandis 在渗透胁迫下的这些通路的调控特征，并识别其中的表达模式和调控关系。有趣的是，这两种通路在 S. capillacea 和 S. purpurea 在干旱胁迫下也显著富集（Yang 等，2020），反映了它们在 Stipeae 植物适应环境变化中的保守功能。

众所周知，植物激素信号传导构成了调节各种非生物胁迫的核心调控网络。在 S. grandis 的 ABA 通路中，PEG 诱导的负调节因子（PP2C）和转录因子（ABF）的上调可能激活了下游的应激响应基因网络，以优化水分保存——这一策略类似于 ABA 介导的 L. chinensis 的干旱适应（Zhao 等，2016）。据报道，在 L. chinensis 中，ABA 的生物合成和信号传导在缺水时暂时被诱导，并在重新补水后停止。在正常情况下，JAZ 通过抑制转录因子 MYC2 和 EIN3 来抑制下游的防御反应（Zhou 等，2025）。EIN3 还可以抑制 MYC2，从而拮抗 jasmonic acid（JA）调节的防御反应（Zheng 等，2017）。在渗透胁迫下，S. grandis 根部 EIN3 和 JAZ 的表达下调，这可能缓解了对 MYC2 的抑制，并激活了由 JA 信号通路介导的生理干旱响应。这与 H. vulgare 和 O. sativa 通过 JAZ 基因的功能丧失促进根生长和增强干旱抗性的机制类似。在 Avena sativa 的叶片中，JAZ 同源基因在干旱条件下上调；水稻 OsJAZ6 的过表达促进了 DELLA 蛋白的降解，从而抑制了分蘖。这与 S. grandis 叶片中 JAZ 和 DELLA 基因的表达模式一致，并可能与叶片抑制高能量防御反应和限制生长有关（Wang 等，2024）。这些基因在不同物种和组织中的表达和遗传效应差异在一定程度上揭示了 EIN3-JAZ-MYC2 模块是禾本科植物适应干旱环境的关键调控单元。GA 信号通过 DELLA 蛋白的积累来调节，它阻断 PIF 转录因子的活性，重新分配光合资源。同时，生长素信号的改变——其特征是生长素响应基因 IAA 的下调和 ARF 基因的上调——可以通过 ARF 介导的转录重编程促进侧根发育，从而增强 S. grandis 的根系结构，以适应水分需求。这与 ZmARF10 在 Z. mays 和 OsARF1 在 O. sativa 中的干旱响应模式一致。

ncRNA 介导的激素信号传导通过 ceRNA 网络发生。在 S. grandis 中，我们发现了 43 个调控其渗透胁迫响应的 miRNAs，这在很大程度上反映了该通路在胁迫条件下的敏感性和响应性，特别是在 BR 和 IAA 通路的调控中。在本研究中，发现叶片中的 DeMiRNA novel-miRNA-95-3p 与 ARF 基因 gmmChr04G002990.1 和 lncRNA TCONS_00062692 形成了 ceRNA 网络，可能通过 Aux1 调节来减少生长素流量，从而刺激侧根分支（Chiou 等，2006；Li 等，2022）。这与研究表明一致，即Z. mays的zma-miR167e/f/j和O. sativa的miR167参与了调节靶基因（如ARFs），以在干旱胁迫下触发生长激素信号通路。在根部，发现lncRNA TCONS_00074847与GH3基因相互作用，可能在早期干旱反应中微调生长激素的稳态。在S. grandis中观察到动态的BR信号模式，其中核心BR受体BRI1调节细胞伸长和抗氧化防御。在玉米中，ZmBRI1a通过ZmNBR1经历自噬依赖性降解以增强耐旱性（Li等，2023年）。同样，我们发现S. grandis的BRI1基因与6种lncRNA和16种miRNA形成了相互作用网络，可能在干旱条件下调节细胞壁木质化和伸长塑性。有趣的是，与BRI1相互作用的DEmiRNA novel-miRNA-7-3p在根部的表达量异常高（TPM > 3,800），这突显了其作为负反馈调节因子的作用，防止BR信号过度激活。此外，我们发现BRI1基因家族完全来源于古老的ρ-WGD事件，这突显了ρ事件在推动草类适应环境变化中的核心作用。在BRI1基因中鉴定出的三核苷酸缺失突变（gmmChr08G000150.1）可能创新了参与S. grandis干旱适应的ncRNA调控网络。淀粉和蔗糖在植物中作为关键的能量储备和代谢枢纽，S. grandis通过碳代谢网络的塑性来适应干旱胁迫。这项研究表明，S. grandis利用时空基因表达和ncRNA调控网络，在模拟干旱条件下建立了“地上-地下协同能量储存”策略。我们的发现表明，关键淀粉生物合成酶基因（SSs、GBSSs、SBEs）在渗透胁迫下协调上调。这一响应模式得到了其他草类研究的支持。在小麦中，灌浆初期干旱显著增强了可溶性淀粉合成酶（SSs）和颗粒结合淀粉合成酶（GBSSs）的活性（Lu等，2018年），而在高粱中，灌浆中后期SSs、GBSSs和淀粉分支酶（SBEs）的活性在干旱条件下发生调节，最终影响淀粉积累（Zhou等，2014年）。值得注意的是，AGPase同源基因表现出组织特异性表达。TCONS_00061984在地上组织中上调1.69倍，增强了光合碳向淀粉的分配，而TCONS_00022017在根部表达量增加了6.69倍。此外，后者与novel-miRNA-141-3p（P15时的TPM = 46.79，P30时下降到31.98）相互作用，动态调节gmmChr04G015330.1，放大地下能量储备。这种“地上快速转化-地下稳定储存”模式与适应放牧的S. grandis所观察到的表型塑性一致，可能有助于其抵御由放牧引起的次生干旱胁迫（Lin等，2018年；Dang等，2021年）。在严重放牧条件下，S. grandis可能通过较高的比叶面积和薄的叶结构优先快速获取资源，而轻度放牧则增强根部储备（例如，提高干物质含量）以缓冲次生干旱的影响。我们的发现显示，PEG处理诱导叶片中α-淀粉酶（AMY）基因（gmmChr04G008830.1、gmmChr20G024640.1）的上调，促进淀粉水解以维持细胞渗透稳态。这一响应与Camellia sinensis中的CsAMY相似（Yue等，2019年）。相反，β-淀粉酶（BMY）基因gmmChr01G012730.1表现出“双向调控”模式，在叶片中上调但在根部被抑制。叶片中β-淀粉酶的干旱诱导上调在玉米中得到了功能支持，其中同源基因ZmBAM8的过表达通过促进叶片淀粉降解增强了耐旱性（Niu等，2024年）。这种差异可能反映了己糖激酶介导的糖信号传导，以协调源和库的动态（Granot等，2013年），说明S. grandis如何通过组织特异性功能专门化实现代谢平衡。在植物中，蔗糖代谢通过SPS/SUS-INV调控轴重新配置。在S. grandis中，随着渗透胁迫强度的增加，SPS和SUS基因逐渐上调，而INV基因下调，共同驱动细胞质中的蔗糖积累。值得注意的是，对Z. mays的研究显示，在干旱胁迫下多个SUS基因显著上调，这直接支持了SUS基因在禾本科植物干旱响应中的重要作用（Wu等，2023年）。在S. grandis中，P30阶段的SUS上调促进了UDP-葡萄糖的合成，不仅为细胞壁增厚提供了前体（Baroja-Fernández等，2012年），还通过调节XTH基因增强了叶片的机械抗性（De Caroli等，2021年）。这种“蔗糖-细胞壁合成耦合”机制可能是草类对抗复合胁迫的进化工具。有趣的是，与miRNAs相比，lncRNA在S. grandis中显著调节淀粉和蔗糖代谢，显示出跨胁迫的保守性。在这项研究中，我们发现，在这一途径中，99种响应渗透胁迫的DEmiRNA与多达329种lncRNA相互作用。lncRNA可能通过吸收miRNAs来缓冲基因表达对环境变化的响应，miRNAs与靶mRNAs竞争并形成核心的基因-miRNA-lncRNA网络。这一机制强调了蔗糖和淀粉代谢在维持S. grandis渗透胁迫下生长中的关键作用。例如，根部lncRNA TCONS_00009247负调控SBE基因，类似于小麦中的lncRNA-SBEIIb（Madhawan等，2020年），而叶片lncRNA TCONS_00077112正调控SS表达。值得注意的是，在S. grandis中，novel-miRNA-126-3p在地上组织中显著上调（P30时比对照高6.17倍）。其靶基因gmmChr11G017400.1（编码β-葡糖苷酶，β-GC）似乎与lncRNAs TCONS_00017861和TCONS_00077508相互作用，形成一个ceRNA网络，可能通过β-GC活性调节次生代谢物的合成。这一机制与Panicum virgatum（Guan等，2024年）和Vitis amurensis（Ma等，2024年）中的应激记忆途径具有显著保守性，可能成为解析S. grandis干旱适应和应激记忆的新靶点。总之，在S. grandis适应干旱环境的过程中，ρ-WGD及其谱系特有的基因复制和扩展不断积累了提高其全面抗逆性的遗传基础。通过基因组结构变异、基因家族的分化以及非编码RNA介导的基因表达调节，它们共同塑造了S. grandis成为欧亚草原的代表性物种，使其成为探索草类适应环境变化的进化过程的理想模型。通过生理、生化和全转录组分析，我们发现S. grandis通过协调激素信号的调节、实施组织特异性的碳代谢策略以及整合ncRNA的转录后调节，形成了多层次的渗透适应调控网络。这不仅使我们理解到草类家族中干旱适应的核心途径具有高度保守性，而且还确定了S. grandis对渗透胁迫的非编码RNA调控网络，为进一步研究其适应潜力的进化创新奠定了基础。

作者声明：作者声明没有利益冲突。

未引用参考文献：Nichols和Johnson，2008年；Yang-Yang等人，2018年；Zhang等人，2014年；Zhang等人，2022年；Zhu等人，2016年。

数据可用性声明：所有相关数据可在手稿及其支持材料中找到。PacBio HiFi全基因组测序数据、Hi-C数据和RNA-seq数据以及全转录组测序数据已存放在NCBI中，BioProject ID为PRJNA1296812（访问号：SRR34717626-SRR34717664），组装和注释数据也存放在NCBI中，BioProject ID为JBPXNI000000000。其他材料和数据可向相应作者索取。

作者贡献声明：
Yue Meng：方法论、研究、数据分析、可视化、初稿写作、审稿与编辑。
Yue Cui：数据分析、研究、可视化、初稿写作。
Wen-Jing Ge：数据分析、研究、可视化、初稿写作。
Ya-Nan Liu：研究、数据分析、可视化、审稿与编辑。
Ting-Yu Huo：方法论、研究、数据分析、审稿与编辑。
Yun-Yun Tian：研究、数据管理。
Zhen-Yun Sun：研究。
Ye-Ming Zhang：研究。
Jia-Ze Li：研究。
Zhen-Hua Dang：概念化、资金获取、数据管理、项目管理、数据分析、初稿写作、审稿与编辑。

作者贡献：
Z.H.D. 设计了这个项目，提交了数据并提供了资金支持。
Z.H.D.、Y.M.、T.Y.H.、Y.N.L.、Y.Y.T.、Z.Y.S.、Y.M.Z.和J.Z.L.准备了材料。
Z.H.D.、Y.M.、Y.C.、W.J.G.和T.Y.H.进行了生物信息学分析。
Z.H.D.、Y.M.、Y.C.、W.J.G.和Y.N.L.撰写并修订了手稿。
W.J.G.和Y.C.收集了样本并进行了实验工作。
Y.Y.T.负责数据提交，并参与了手稿的编辑和改进。
所有作者都审阅了手稿。

资助：
本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号32160088和32460092）、内蒙古自治区自然科学基金（2024JQ11）、内蒙古自治区高校青年科技人才计划（NJYT22093）以及内蒙古自治区科技计划项目（2025KYPT0012）的财政支持。