《Plant Science》：Establishment of a high-efficiency transient expression system for subcellular localization studies in plants based on vacuum-assisted Agrobacterium infiltration
编辑推荐：
开发了真空辅助农杆菌转化系统，利用幼苗根和下胚轴作为 explants，成功实现多种亚细胞定位蛋白（如GFP-GmHSP40.1、JMJ14-RFP等）在烟草和拟南芥中的表达，突破传统农杆菌转化局限于叶片和少数物种的限制，实验周期缩短至10天以内，适用于多物种高通量研究。
胡娇兰|易宁珂|刘天耀|马晓涵|刘建中
浙江师范大学生命科学学院，金华321004，中国
摘要
在Nicotiana benthamiana叶片中通过农杆菌介导的瞬时表达是一种广泛用于分析荧光蛋白（FP）标记融合蛋白亚细胞定位的方法。然而，这种技术主要局限于叶片组织，并且仅适用于有限的植物物种。在这里，我们建立了一种基于真空渗透的瞬时表达系统，成功地利用不同植物物种5天大幼苗的根和胚根作为外植体，表达了具有多种亚细胞定位的蛋白质。这种方法扩展了真空渗透的应用范围，超越了胚叶和拟南芥的限制，有效地规避了传统农杆菌渗透技术的组织特异性，缩短了实验周期，并且易于适应多种植物物种。总体而言，这些优势使得该方法成为一种快速、多功能且适用范围广泛的系统，适用于研究多种植物模型中的蛋白质亚细胞定位。
引言
农杆菌介导的瞬时表达是一种高效且便捷的植物基因表达调控技术。该方法利用农杆菌的天然转化机制，通过T-DNA将外源基因引入植物细胞，无需基因组整合，从而能够快速大规模生产重组蛋白（Lacroix和Citovsky，2013）。与其他转化方法相比，它具有操作简单、转化效率高以及组织损伤小的显著优势，使其成为当代植物基因功能研究中最通用和有效的工具之一。基于荧光蛋白（FP）的构建体被广泛用于监测蛋白质的亚细胞定位，而农杆菌介导的瞬时表达已成为这类研究中的首选方法（Koroleva等，2005；Sparkes等，2006）。通过将荧光标签与目标蛋白融合，并用农杆菌感染活组织，可以在短时间内实现高水平的表达。该技术已成功应用于多种植物，包括烟草（Nicotiana）和Arabidopsis thaliana（Boevink等，1998；Batoko等，2000；daSilva等，2004；Runions等，2006）。
目前，注射法主要用于叶片表皮细胞的瞬时表达（Batoko等，2000；Grefen等，2008）。这种传统方法的一个关键限制是它依赖于2-4周大的植物叶片作为表达系统，导致实验周期较长且效率较低。为了解决这些效率问题，真空辅助的农杆菌渗透技术作为一种可行的替代方案应运而生，可以在幼苗中实现瞬时表达，而无需注射。该方法利用负压环境（通常为0.08–0.1 Mpa）在植物组织内部建立压力梯度，促进农杆菌悬浮液通过气孔或细胞间隙进入目标组织（Bechtold和Pelletier，1998；Tague和Mantis，2006）。与叶片渗透相比，真空渗透使用幼苗作为实验材料，将从播种到实验完成的整个周期缩短至不到10天，显著提高了实验效率（Ye等，1999；Bechtold和Pelletier，1998）。真空辅助的瞬时转化技术已成功应用于拟南芥、水稻（Oryza sativa）和大豆（Glycine max），使用了GUS（β-葡萄糖醛酸酶基因）启动子驱动的构建体（Ye等，1999；Bechtold和Pelletier，1998；Yao等，2024）。然而，GUS活性检测具有破坏性，无法实时观察蛋白质的亚细胞定位和相互作用。尽管该方法已用于亚细胞定位研究，但其应用范围仍主要局限于拟南芥和Nicotiana物种的叶片组织（Marion等，2008；Bernat-Silvestre等，2021；Shi等，2024；Yao等，2024）。最近，研究人员在水稻的胚芽鞘和根以及胚叶表皮细胞中也成功表达了GFP（Burman等，2020）。然而，低表达效率和组织特异性障碍限制了其广泛应用。
为了建立一种在非叶片组织中研究蛋白质亚细胞定位的高效系统，我们开发了一种基于真空辅助的农杆菌瞬时表达系统，使用5天大幼苗的根和胚根作为外植体。利用这种方法，我们成功地在拟南芥和N. benthamiana的根和胚根中实现了多种具有不同亚细胞定位的蛋白质的亚细胞定位和共定位研究。这种方法有效地规避了传统农杆菌渗透技术的组织特异性，显著缩短了实验周期，并且易于适应多种植物物种。
章节摘录
真空辅助的农杆菌渗透技术能够在Nicotiana benthamiana 5天大幼苗的胚根中实现多亚细胞定位蛋白质的瞬时表达
农杆菌介导的瞬时过表达是一种快速高效的植物基因功能研究技术。传统方法通常使用注射法在N. benthamiana叶片中实现瞬时表达，但这种方法仅限于叶片，并且实验周期较长。为了打破这些限制，我们对之前开发的真空辅助农杆菌感染技术进行了改进（Ye等，1999；Bechtold和Pelletier，1998），以用于蛋白质的亚细胞定位。
讨论
利用真空辅助的农杆菌渗透系统，我们成功地在N. benthamiana幼苗的胚根细胞以及Arabidopsis thaliana幼苗的胚根和根细胞中，实现了与不同荧光蛋白融合的蛋白质在特定亚细胞结构中的亚细胞定位。
在N. benthamiana的胚根细胞中，我们分别表达了GFP-GmHSP40.1、JMJ14-RFP、NtAOX2-RFP、CBL1-mCherry、ER-mCherry、GFP-ATG8h和Free-GFP（见图1和补充图1）。
质粒构建
GFP-GmHSP40.1、JMJ14-RFP、ER-mCherry、GFP-ATG8h和HcRED-SE构建体之前已有报道（Zhang等，2025；Liu和Whitham，2013；Nelson等，2007；Lan等，2024）。为了生成AOX2-RFP构建体，使用引物F1: aaaGGTACCATGTGGGTTAGGCATTTT和R1: GGAGCCACCGCCACCAGAGCCACGGGTGATACCCAATTGGTGCT扩增了烟草AOX2的全长编码区。RFP的全长序列则使用引物F2: GGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGCTCCATGGCCTCCTCCGAGGA和R2进行扩增：
CRediT作者贡献声明
马晓涵：方法学设计。刘天耀：实验研究。刘建中：撰写 – 审稿与编辑、撰写初稿、监督、实验研究、资金获取、概念构思。易宁珂：实验研究。胡娇兰：撰写初稿、方法学设计、实验研究。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32170761）的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
