基于PtPd纳米颗粒/g-C3N4电化学适配体传感器与锁式DNA酶扩增策略的超灵敏ATP检测方法

《Talanta》：An electrochemical aptasensor based on PtPd NPs/g-C3N4 and a locked DNAzyme amplification strategy for ultrasensitive ATP detection

ATP检测电化学aptasensor研究：采用PtPd/g-C3N4纳米复合材料结合DNAzyme锁定与双信号放大策略，实现1.71 fM超低检测限，成功应用于啤酒样本检测，提升食品安全监测灵敏度。

　　

作者：杜根安（Gengan Du）、郑瑞娜（Ruina Zheng）、孔维迪（Weidi Kong）、王龙（Long Wang）、何宝山（Baoshan He）、郭琪（Qi Guo）

单位：中国河南省工业大学食品与战略储备学院，粮食储存与安全工程研究中心，郑州，450001

摘要

三磷酸腺苷（ATP）是广泛认可的微生物污染指标，其快速准确的检测对于评估食品安全中的微生物污染至关重要。本文开发了一种集成双信号放大策略的电化学适配体传感器，用于超灵敏地检测ATP。使用铂钯/石墨碳氮化物（PtPd NPs/g-C₃N₄）作为电极修饰材料，不仅提高了导电性和电活性表面积，还为生物分子固定提供了有利平台。此外，引入了一种适配体调控的DNA酶锁定策略来控制信号：初始时DNA酶通过与两个适配体序列杂交而失活，ATP结合后适配体发生构象变化并与DNA酶解离，从而恢复其催化活性。激活的DNA酶在Mg²⁺存在下催化电极表面底物DNA链的环状切割，实现显著信号放大。在优化条件下，该适配体传感器表现出优异的分析性能，线性范围为10 pM至10 μM，检测限低至1.71 fM。此外，该传感器具有良好的选择性、稳定性和重复性，并成功应用于啤酒样品中的ATP检测。这一策略为微量ATP分析提供了灵敏的方法，在食品安全分析中具有应用潜力。

引言

微生物污染对食品安全和人类健康构成重大威胁[1]。食源性病原体的繁殖和代谢活动会降低食品质量并对人类健康构成风险[2,3]。三磷酸腺苷（ATP）是所有活细胞中的关键分子，在细胞代谢和能量转移中起关键作用[4]。作为代谢活动的基本生物标志物，ATP浓度能有效反映微生物的活力和生物量[5],[6],[7]。因此，定量分析ATP为评估食品中的微生物污染提供了快速可靠的方法，从而支持卫生监测和风险评估。

迄今为止，ATP检测方法可分为色谱法、电泳法和光学技术[8],[9],[10]。其中，毛细管电泳[11]、高效液相色谱（HPLC）[12]和生物发光[13]能够实现精确定量，但通常受到繁琐样品制备、昂贵仪器和复杂工作流程的限制。这些固有缺点严重阻碍了它们在现场和实时监测中的应用[14,15]。因此，开发更简单、更快、更灵敏和更便携的ATP检测方法至关重要。在这方面，电化学分析因其快速响应、操作简便和易于微型化而成为极具吸引力的替代方案。

尽管电化学方法本身具有快速性和灵敏性，但在食品样品等复杂基质中的性能常受干扰物质的影响[16]。为解决这一问题，结合电化学技术的快速灵敏特性和生物分子的特异性识别能力的电化学生物传感器受到了越来越多的关注[17,18]。在各种生物识别元件中，适配体因其独特优势而被广泛认为是传统抗体的理想替代品[19]。适配体是通过指数富集法系统进化选出的单链DNA或RNA序列，具有与抗体相当的亲和力和特异性，同时还具有优异的热稳定性和低合成成本以及易于化学修饰的特点。这些特性使适配体成为开发高性能电化学传感器的理想识别元件[20]。最近已开发出多种用于ATP分析的电化学适配体传感器，显示出显著的应用潜力[21],[22],[23],[24]。

电化学适配体传感器开发中的一个核心挑战是实现高效的信号放大以提高检测灵敏度[25,26]。电极界面的功能修饰是解决这一挑战的基本策略。纳米材料因其较大的比表面积、优异的导电性和良好的生物相容性而被广泛用于构建电化学传感平台[27,28]。基于碳的材料、金属纳米颗粒和金属氧化物在信号放大方面展现出显著潜力[29]。石墨碳氮化物（g-C₃N₄）是一种通常以纳米片形式存在的二维聚合物材料，由于其结构稳定性和较大的表面积，被认为是传感器开发的理想基底[30,31]。然而，其本身的导电性较差，限制了界面处的电子传递效率，从而限制了其在高性能传感器中的应用[32]。一种有效的解决方案是在g-C₃N₄表面修饰高导电性的贵金属纳米颗粒。虽然单金属纳米颗粒（如金和银）因其高导电性和对巯基化探针的亲和力而被广泛使用，但双金属纳米颗粒通常由于协同效应而表现出更好的电子传递能力。在这方面，双金属铂钯纳米颗粒（PtPd NPs）具有明显优势。得益于Pt和Pd之间的协同作用，PtPd NPs对氧化还原物种表现出增强的电催化活性，并具有丰富的活性位点，可通过金属-S键稳定固定巯基化DNA探针[33]。因此，通过将PtPd NPs修饰到g-C₃N₄纳米片上制备了PtPd NPs/g-C₃N₄纳米复合材料。在这种结构中，g-C₃N₄作为优良的二维支撑层，有效防止PtPd NPs聚集并确保均匀分散。同时，高导电性的PtPd NPs在g-C₃N₄表面形成强大的电子传输网络，显著提高整体导电性[34]。这种协同作用不仅促进了高效的信号放大，还为高密度探针固定创造了最佳界面。

除了界面功能化外，引入独立的信号放大策略是实现高灵敏检测的另一个关键途径[35]。通过合理设计核酸序列或使用酶促反应，已经开发出多种放大策略，包括催化发夹组装、杂交链反应和酶辅助放大[36]。这些方法将单个目标识别事件转化为多个信号输出，从而实现指数级放大。值得注意的是，酶辅助的目标回收已成为一种有前景的方法。常用的酶包括DNA聚合酶、内切酶和外切酶[37]。然而，传统蛋白质酶需要严格的反应条件且稳定性较差，限制了其在实际应用中的可靠性。因此，脱氧核酶（DNA酶）引起了越来越多的关注[38]。DNA酶可以在特定金属离子存在下特异性切割底物DNA链，从而提高电化学适配体对痕量目标的灵敏度。然而，非特异性吸附和不良反应导致的信号元件错误激活在实际应用中带来挑战，增加了背景噪声并降低了选择性[39]。在酶促放大系统中，这一问题尤为突出，因为不受控制的催化活性可能在目标引入前导致信号泄漏，严重损害灵敏度和可靠性。为解决这一问题，最近引入了锁定机制来调节信号启动，从而减少背景干扰并提高检测选择性。例如，张等人提出了一种基于双适配体触发DNA三元复合物系统的锁释放机制，仅在目标结合时释放信号元件，有效抑制背景干扰[40]。受此启发，我们将锁控设计与DNA酶催化的放大结合，开发了一种基于双适配体协同识别的酶活性调节系统。在该系统中，两个ATP适配体与DNA酶的两端杂交，将其催化核心锁定为非活性构象。目标结合后，适配体从DNA酶上解离，恢复其催化活性。这种目标触发的解锁机制显著降低了背景信号，提高了反应选择性和响应精度。

通过将PtPd NPs/g-C₃N₄纳米复合材料与基于锁控DNA酶的目标诱导信号放大策略相结合，开发了一种新型电化学适配体传感器，用于高灵敏度ATP检测（图1）。其出色的性能源于双重放大机制：PtPd NPs/g-C₃N₄复合材料提供了高表面积的功能界面，增强了探针负载和电子传输；而锁控的DNA酶在ATP识别后通过Mg²⁺依赖的循环切割电极结合的互补DNA（c-DNA）实现目标激活的信号放大。这种协同策略使适配体具有超低检测限和优异的选择性，并已用于啤酒样品中的ATP定量，显示出实际应用的巨大潜力。

试剂和仪器

所有试剂和仪器的详细清单见支持信息。本研究中使用的所有寡核苷酸序列均由上海桑贡生物技术有限公司（上海）通过HPLC合成和纯化，详细序列列于表1中。

PtPd NPs/g-C₃N₄纳米复合材料的合成

g-C₃N₄、PtPd NPs及最终PtPd NPs/g-C₃N₄复合材料的详细合成方案见支持信息。

Apt1/DNAzyme/Apt2复合体的合成

Apt1/DNAzyme/Apt2复合体的合成方法如前所述[40]。

材料表征

使用透射电子显微镜（TEM）研究了PtPd NPs、g-C₃N₄和PtPd NPs/g-C₃N₄的形态、结构和元素组成。如图2A所示，PtPd纳米颗粒呈均匀球形，具有高单分散性。图2B展示了g-C₃N₄的形态，显示出具有丰富褶皱的超薄二维纳米片结构，这有助于形成较大的比表面积。图2C显示了单个

结论

总之，我们通过将PtPd NPs/g-C₃N₄纳米复合材料与DNA酶介导的目标回收放大策略相结合，成功开发了一种用于ATP检测的电化学适配体传感器。PtPd NPs/g-C₃N₄纳米复合材料赋予传感界面高导电性和大表面积，促进了生物分子固定和电子传递。同时，开发了一种锁控信号放大策略，其中ATP识别激活DNA酶，从而

CRediT作者贡献声明

杜根安（Gengan Du）：正式分析、研究、可视化、撰写——初稿。郑瑞娜（Ruina Zheng）：正式分析、软件处理。孔维迪（Weidi Kong）：验证。王龙（Long Wang）：资源提供。何宝山（Baoshan He）：概念构思、监督、撰写及审稿编辑。郭琪（Qi Guo）：资金获取、资源协调、监督。

利益冲突声明

我们声明与提交的工作无关任何商业或关联利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号32502227）、河南省自然科学基金（编号252300421650）、河南省工业大学高层次人才科研基金（编号2024BS034）以及河南省高等学校重点科研项目（编号26A550016）的支持。