iFLinkC-EZ：一种基于iFLinkC框架、可规模化与自动化组装复杂融合蛋白及多基因表达载体的新方法

《Synthetic and Systems Biotechnology》：iFLinkC-EZ: A scalable and automatable method for the assembly of complex fusion proteins and multi-gene expression constructs based on the iFLinkC framework

本文聚焦于合成生物学中DNA组装方法的技术瓶颈。为克服现有方法在组装复杂融合蛋白时存在的操作繁琐、难以自动化等问题，研究团队开发了名为iFLinkC-EZ的新算法。该技术通过基因纯化替代物理纯化，显著简化了流程，将基本组装周期缩短至一天，并实现了与机器人自动化兼容。研究成功将其应用于组装多色荧光融合蛋白与多顺反子表达载体，证明了其在构建合成蛋白开关、传感器及多酶复合物等方面的广泛应用潜力，为相关领域研究提供了强大且易用的工具。

　　

在合成生物学、生物技术和基础研究的舞台上，DNA构建体的组装如同搭积木，是构筑一切生物功能元件的基石。理想的方法应兼具低成本、低技能要求、低操作难度和高保真度，并且易于规模化及实现机器人自动化。目前，基于同源重组和非同源重组（如Golden Gate）的方法各有所长，但在组装复杂融合蛋白时却面临着“水土不服”的困境。例如，高度标准化的模块化克隆（MoClo）框架虽然擅长组装转录单元和多基因表达构建体，但其预定义的部件位置限制了它在融合蛋白组装中所需的灵活性——毕竟，蛋白结构域和连接肽（linker）的排列组合需要极大的自由度。此前，迭代功能性连接肽克隆（iFLinkC）方法的出现为从零开始组装任意大小和复杂度的蛋白质编码序列提供了标准化框架，但它有一个“阿喀琉斯之踵”：需要借助琼脂糖凝胶电泳物理纯化DNA片段，这带来了显著的操作复杂性，对操作者技能要求高，也阻碍了自动化。

那么，能否找到一种更优雅的方式，在保留iFLinkC灵活性的同时，让它变得像“EZ”（容易）一样简单呢？来自德国达姆施塔特工业大学的Philipp Kemp、Viktor Stein等人及其团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》上发表的研究，给出了肯定的答案。他们开发了名为iFLinkC-EZ的新组装算法，核心创新在于用“基因纯化”取代了“物理纯化”。通过交替使用抗生素抗性标记和ccdB反选择，在转化后自动清除输入DNA，彻底告别了繁琐的凝胶纯化步骤。这一改变不仅大幅简化了流程，将基本组装周期从两天缩短至一天，更使得整个流程与机器人自动化完美兼容。研究团队成功利用iFLinkC-EZ组装了单色与多色荧光融合蛋白，评估了不同连接肽对蛋白功能表达的影响，并证明了其在酵母展示中增强标记的能力。此外，通过引入专用适配器模块，iFLinkC-EZ还能与Golden Gate等其他DNA组装策略对接，用于构建大型多顺反子表达载体。这项研究为灵活、高效、自动化地构建复杂融合蛋白和多基因回路铺平了道路。

为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术方法：1. iFLinkC-EZ DNA组装流程：基于BtsI、BsrDI/SapI和BbsI/BsaI等IIs型限制性内切酶与T4 DNA连接酶的序贯作用，在目标质粒（pZ/pZHiX）中线性组装DNA，并利用T5核酸外切酶去除线性DNA污染物，通过抗生素抗性转换与ccdB反选择进行基因纯化。2. 机器人自动化平台集成：在CompuGene机器人平台上，使用I.DOT纳升分液器等设备，通过LARAsuit控制软件全自动执行iFLinkC-EZ组装循环。3. 多荧光蛋白融合构建体组装与功能验证：组装了由(GGS)₃或(TP)₄T连接肽串联的1-5拷贝mCherry（单色）及mCherry_1-4-sfGFP（多色）融合蛋白。4. 酵母展示（yeast display）技术：将sfGFP特异性纳米抗体展示在酵母细胞表面，用于测试多荧光融合蛋白的抗原标记效率。5. 多顺反子载体组装：通过引入带有BsmBI酶切位点的适配器模块，将iFLinkC-EZ组装的单个翻译单元（translation unit）通过Golden Gate组装成多顺反子（poly-cistronic）表达载体。

研究结果

2.1. iFLinkC-EZ的设计构思

iFLinkC-EZ保留了原始iFLinkC迭代组装的核心优势，但通过省略5'端的限制性位点，并直接在目标质粒pZ/pZHiX中线性组装DNA构建体，简化了流程。其核心改进在于利用交替的抗生素抗性和ccdB反选择来遗传性地清除输入DNA，从而省去了琼脂糖凝胶电泳纯化步骤，降低了操作复杂性并将基本组装周期缩短至一天。相比原始流程，还使用SapI/BspQI替换了BsrDI以提高效率和可靠性。

2.2. iFLinkC-EZ的实验实施

实验表明，无论是手动操作还是机器人自动化，iFLinkC-EZ均表现出高效率和严苛性。手动组装每5μL反应可产生数百个克隆，且测序验证正确率高。当省略T4 DNA连接酶时，未观察到任何背景克隆，证明反选择系统有效。在机器人自动化平台上，即使将酶稀释10倍以适应纳升分液器，也未观察到组装严苛性的降低，证明了其稳健性、可扩展性和成本效益。

2.3. 使用iFLinkC-EZ迭代组装大型重复DNA构建体

研究评估了iFLinkC-EZ在组装多荧光融合蛋白（poly-fluorescent fusion proteins）方面的能力，这对任何DNA组装方法都是挑战，因为涉及高度同源的重复序列。团队成功组装了由(GGS)₃或(TP)₄T连接肽串联的、包含多达5个拷贝mCherry的单色多荧光蛋白。组装保真度高，转化效率在2.7×10⁴–1.6×10⁵CFU/μg DNA之间。尽管重复性高，这些构建体在大肠杆菌中传代超过80代后仍保持稳定。功能表达分析显示，所有构建体均产生可比的红色荧光信号，但随mCherry拷贝数增加，信号有小幅比例性下降。将sfGFP融合到多达4个mCherry拷贝的C端后，sfGFP信号随mCherry拷贝数增加而下降，且(GGS)₃连接肽构建体的sfGFP与mCherry荧光比值优于(TP)₄T连接肽构建体，表明(GGS)₃连接肽可能产生更多全长的功能性蛋白。在酵母展示应用中，多mCherry-sfGFP融合蛋白能有效标记展示sfGFP纳米抗体的酵母细胞，荧光信号在2个mCherry拷贝时达到峰值，随后趋于平稳并在4个拷贝时下降。

2.4. 通过适配器模块扩展iFLinkC-EZ以实现Golden Gate组装

为克服线性组装模式在构建大型多基因表达载体时步骤较多的限制，iFLinkC-EZ可通过引入编码特定DNA重组位点（如BsmBI酶切位点）的适配器模块，与Golden Gate等其他组装方法兼容。研究演示了先利用iFLinkC-EZ组装单个翻译单元（含核糖体结合位点RBS、荧光蛋白编码序列和终止子），再通过Golden Gate将它们组装成多顺反子表达载体。组装效率高，每5μL反应可获得超过50个克隆。与由相同荧光蛋白通过(GGS)₃或(TP)₄T连接肽直接融合而成的多荧光融合蛋白相比，多顺反子构建体中各荧光蛋白的表达水平变异更大（即使使用相同的RBS），且在某些大肠杆菌菌株中表现出毒性或生长延迟，显示了多顺反子表达的环境依赖性。

研究结论与意义

本研究开发的iFLinkC-EZ是一种简化且可自动化的、以蛋白质为中心的DNA组装方法。它通过遗传纯化取代物理纯化，在保留原始iFLinkC方法灵活性的同时（可不受方向、长度和序列复杂性限制地迭代重组蛋白质编码序列），显著降低了操作复杂性、缩短了周期并实现了机器人自动化。与MoClo（模块化克隆）和Gibson Assembly（吉布森组装）等方法的对比凸显了其优势，特别是在组装复杂融合蛋白方面。iFLinkC-EZ在组装高重复性的多荧光融合蛋白上展示了高效能和严谨性，功能实验验证了其在酵母展示等应用中的实用性。连接肽比较表明，(GGS)₃连接肽在促进全长蛋白表达方面略有优势，而(TP)₄T连接肽则在物理分离结构域方面特性更优。更重要的是，通过引入适配器模块，iFLinkC-EZ能够与Golden Gate等标准组装框架无缝对接，用于构建大型多基因表达载体，这极大地扩展了其应用范围和互操作性。

该研究的核心意义在于，iFLinkC-EZ为合成生物学领域提供了一种强大、易用且通用的工具，特别适用于需要高度灵活性和组合优化的场景，例如构建合成蛋白开关、传感器、多酶复合物、遗传电路和代谢途径。它将加速复杂蛋白质设计和多基因系统构建的进程，降低技术门槛，并推动相关研究向更高通量和自动化方向发展。