疏水性深共晶溶剂（HDES）作为从玛雅章鱼副产品中提取Omega-3脂肪酸的替代方法 作者：Daniela Aguilar-González, Ian López-álvarez, Juan V. Cauich-Rodríguez, Teresa Cerón-Carrillo, Ingrid Mayanin Rodríguez-Buenfil, Manuel Octavio Ramírez-Sucre

《Processes》：Hydrophobic Deep Eutectic Solvents (HDES) as an Alternative for the Extraction of Omega-3 Fatty Acids from Octopus maya By-Products Daniela Aguilar-González, Ian López-álvarez, Juan V. Cauich-Rodríguez, Teresa Cerón-Carrillo, Ingrid Mayanin Rodríguez-Buenfil and Manuel Octavio Ramírez-Sucre

　　摘要：本研究评估了使用氢键受体深共晶溶剂（HDES）从墨西哥尤卡坦半岛特有物种Octopus maya的副产物中提取ω-3脂肪酸的效果。采用2 × 3 × 2因子实验设计来考察以下因素的影响：（1）氢键受体（HBA，分别为薄荷醇或桉叶醇）与作为氢键供体的油酸；（2）摩尔比（MR，分别为1:1、1:2或2:1）；（3）超声辅助提取时间（ET，分别为30分钟或60分钟）。提取的ω-3含量（EO3，单位为mg/mL）通过UV-Vis分光光度法和粘度测量进行测定，实验重复两次（n = 2），结果以平均值±标准差表示。数据分析采用Minitab?（版本18）软件中的DOE（实验设计）方法。最终筛选出ω-3含量最高的样品，并通过FTIR、拉曼光谱和气相色谱技术确认其成分。结果显示，在桉叶醇摩尔比为1:2且提取时间为30分钟的情况下，ω-3含量最高（0.70 mg/mL）。统计分析表明，ω-3的提取效果受到HBA、MR和ET三因素交互作用的显著影响（p < 0.05），这说明提取效率受溶剂组成和提取条件的共同影响。所有提取物的粘度均符合牛顿流体特性，范围在0.011至0.036 Pa·s之间，其中含桉叶醇的提取物粘度最低。脂肪酸分析结果显示C16:0、C18:0、C18:1 n-9、C18:2 n-6和C18:3 n-3等 fatty acid的含量，其中多不饱和脂肪酸（尤其是ω-6）的含量较高（占23.45–27.91%），而饱和脂肪酸（如棕榈酸和硬脂酸）的含量较低。这些结果表明HDES是一种适用于选择性提取的可持续替代方案。

1. 引言
墨西哥尤卡坦半岛的章鱼产业主要以Octopus maya为主，这种特有物种支撑了约16,000个就业岗位，年产值高达3,600万美元[1,2,3]，2025年的产量达到25,462吨[4]。在加工过程中产生的副产物（如章鱼触手尖端和头部）大多未被利用甚至被丢弃，导致水体、土壤和空气污染[5]。然而，这些副产物富含高价值的生物分子，包括蛋白质（胶原蛋白，含量为77.5 g/100 g干重）和多不饱和脂肪酸（PUFA），特别是ω-6（110 mg/100 g干重）及ω-3（144 mg/100 g干重），如二十碳五烯酸（EPA，20:5 n-3）和二十二碳六烯酸（DHA，22:6 n-3）[6]。这些化合物对人体健康至关重要，具有抗炎作用、降低心血管疾病风险、维护视力健康以及促进大脑、肝脏和心脏等功能的关键器官正常运作的作用[7]。Calder等人[7]指出，普通人群每天摄入250毫克ω-3有助于预防帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病。为发挥这些生物效应，ω-6与ω-3的摄入比例应维持在1:1至5:1之间[8,9]。章鱼中的PUFA主要存在于肌肉组织和细胞膜中，多以三酰甘油和磷脂的形式存在，这可能限制了它们与溶剂的相互作用，从而影响提取效率[10]。因此，选择合适的提取方法和溶剂系统对于提高脂质回收率和选择性至关重要。

2. 材料与方法
2.1. 溶剂与试剂
所有试剂均从商业供应商处购买，包括：薄荷醇晶体（纯度100%），Dermiquim化学溶液（墨西哥哈利斯科州）；油酸（纯度≥99%），Favela Pro公司（墨西哥锡那罗亚州）；桉叶醇（纯度99%），SAFC Supply Solutions公司（美国密苏里州）；乙醇（纯度99.9%），Chemical products Monterrey公司（墨西哥新莱昂州）；甲醇，Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州）；以及氯仿（Mallinckrodt Baker公司，墨西哥埃多州），均为分析级。用于构建校准曲线的ω-3标准品（100%挪威鲑鱼油，Natural Health II?，标签上标注ω-3含量为52.68%）购自墨西哥尤卡坦州梅里达市的Costco药店。

2.2. Octopus maya样本采集
样本采集于2023–2024年渔业季节期间，遵循墨西哥尤卡坦半岛的合法捕捞规定（NOM-008-PESC-1993），作为“Plataforma tecnológica pulpo maya para el desarrollo de productos de alto valor agregado 6559”项目的一部分。采集后的样本被冷冻以备后续分析。

2.3. Octopus maya副产物的处理
从本节开始，“副产物”特指Octopus maya的头部。随机选取样本，通过切割去除头部部分。处理后的副产物经清洗、混合后装入250克密封袋（Ziploc? SC Johnson，美国威斯康星州拉辛市）中，在-20°C下保存72小时。随后在-84°C下进行冷冻干燥（Freezone设备，美国密苏里州堪萨斯城LABCONCO公司），干燥时间为96小时。冷冻干燥后的样品通过商用搅拌机（Oster?，型号BLST4127，美国波士顿市）研磨，并通过孔径为500 μm的不锈钢筛网过滤，得到均匀的颗粒物质。生成的副产物粉末储存在密封容器中，并在室温下的干燥器中保存以防止吸湿。

2.4. 传统油脂提取（COE）
油脂提取方法参考Kuo等人的研究[26]并进行了改进。将10克冷冻干燥后的Octopus maya副产物粉末与100毫升乙醇混合，使用高速分散器（ULTRA-TURRAX? T 18数字型，德国ICAK Works Inc.，施陶芬）以15,000转/分钟的速度搅拌1分钟。随后在超声浴（BRANSON?，型号351，频率42 kHz，美国康涅狄格州丹伯里）中进行30分钟的超声辅助提取（UAE）。样品在4°C下以4500转/分钟的速度离心30分钟以沉淀固体杂质。有机相（乙醇）收集后再次离心以去除残留杂质。最后使用旋转蒸发器（Laborota V-700，Heidolph Instruments GmbH & Co. KG，德国施瓦巴赫）在300 mbar压力和60°C条件下浓缩。传统乙醇提取方法作为参考，用于确认Octopus maya副产物中是否含有脂质化合物，并为与HDES提取方法的半定量比较提供依据。由于提取过程和分析方法的差异，此比较旨在揭示相对趋势而非建立直接定量关系。

2.5. HDES的制备
HDES的制备参照Ramírez-Sucre等人的方法[27]进行改进。以油酸（282.46 g/mol）作为氢键供体（HBD），薄荷醇（156.27 g/mol）和桉叶醇（154.25 g/mol）作为氢键受体（HBA），摩尔比为1:1、1:2或2:1。含有油酸和薄荷醇的HDES在40°C下加热并不断搅拌至混合均匀；而含有桉叶醇的HDES则在室温下搅拌直至两种成分完全混合。

2.6. 使用HDES进行超声波辅助提取（UAE）的脂肪酸提取
为了研究氢键受体（HBA）、摩尔比（MR）和提取时间（ET）对ω-3提取效果的影响，设计了2 × 3 × 2因子实验（每个处理重复三次）。因子水平包括HBA（薄荷醇或桉树脑）、MR（1:1、1:2或2:1）以及ET（30分钟或60分钟），如表1所示。表1提出了实验设计，包括氢键受体（HBA）、摩尔比以及UAE（超声辅助提取）时间等因子与响应变量。PUFA的提取采用HDES方法进行，该方法依据Ramírez-Sucre等人[27]的描述，并进行了修改。将10克HDES与1克Octopus maya副产品面粉混合，然后根据实验设计使用超声波浴（BRANSON?，型号351，42 kHz，美国康涅狄格州丹伯里）进行30分钟或60分钟的超声辅助提取。样品在4℃下以4500转/分钟的速度离心15分钟后，收集上清液，并将提取物储存在4℃下以备进一步分析。

2.7 HDES提取物的粘度分析
使用具有平行板几何结构（直径40毫米）和1050微米间隙的控应力流变仪（Discovery Hybrid Rheometer DHR-2，TA Instruments，美国新卡斯尔）测定从Octopus maya副产品中获得的HDES提取物的粘度，具体方法依据Ramírez-Sucre和Baigts-Allende[28]的描述。在25℃的恒温下，通过粘度曲线（Pa·s）评估剪切率（0.001至100 s?1）下的流动行为。

2.8 通过UV–Vis光谱法测定Omega-3当量
根据Oliveira等人[29]的方法，并进行修改，使用UV-Vis光谱法测定HDES提取物中的Omega-3当量（EO3）。使用omega-3（100%三文鱼油，含52.68% ω-3）稀释在氯仿：甲醇（2:1，v/v）溶液中，制备了五点校准曲线（50、200、300、600和1200 μg/mL）。每个校准点均使用UV–Vis光谱仪（THERMO SCIENTIFIC?，型号Genesys 140，墨西哥城）在202纳米处进行测量。校准曲线的相关系数（R2）为0.961，相关公式为：
\[ \text{EO3} (\text{mg/mL}) = A \times (\text{Abs} / \text{Abs}_0) \]
其中A为校准常数，\(\text{Abs}\)为代表202纳米处吸光度的值。该公式用于根据测量得到的吸光度值估算HDES提取物中Omega-3当量的相对浓度。
需要注意的是，202纳米处的UV–Vis吸光度与不饱和化合物的存在相关，并非Omega-3脂肪酸的特有指标。因此，报告的EO3（mg/mL）值是基于校准标准（样品三文鱼油中含52.68% ω-3）的相对和间接估算，而不是Omega-3脂肪酸的绝对定量。因此，UV–Vis分析作为一种半定量方法用于比较不同处理之间的相对差异。结果以mg/mL的EO3表示，并解释为不饱和度的相对变化，而非Omega-3含量的绝对值。

基于这些结果，选择了EO3含量最高的四个样品进行脂肪酸谱分析，并进一步通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼光谱（Raman spectroscopy）进行了分析。

2.9 气相色谱法（GC）的脂肪酸谱分析
脂肪酸的表征按照NMX-F-490-1999-NORMEX标准进行。样品甲基化过程是将氢氧化钠加入含玻璃珠的甲醇中，然后连接到Friedrich冷凝器上并置于70℃的水浴中。从出现第一滴液体开始，回流12分钟。随后加入硼 trifluoride（BF3）的甲醇溶液，继续回流2分钟。加入庚烷后，再回流1分钟。反应完成后，取出烧瓶，暂时封盖并用冷水冷却。加入饱和氯化钠（NaCl）溶液以促进相分离。上层液体转移到2毫升小瓶中并密封。甲基化样品随后注入配备火焰离子化检测器（FID）的PerkinElmer气相色谱仪中，以 split mode（40:1）进行1微升的注入。使用DB-23毛细管柱（60米×0.25毫米×0.25微米）。进样器温度设定为220℃，烤箱温度从60℃以25℃/分钟的速度升高至250℃，FID温度维持为275℃。脂肪酸[棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1 n-9）、亚油酸（C18:2 n-6）、亚麻酸（C18:3 n-3）、Omega-3（ω-3）、Omega-6（ω-6）和Omega-9（ω-9）的定量采用NMX-F-490-1999-NORMEX标准中的归一化方法进行，结果以脂肪酸百分比（%）表示。

2.10 傅里叶变换红外光谱（FTIR）
HDES提取物的官能团表征按照áviles-Betanzos等人[30]的方法，并进行修改。分析使用Nicolet iS5光谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国威斯康星州麦迪逊），该光谱仪配备有锗晶体衰减全反射（ATR）附件。光谱扫描范围为4000至500 cm?1，采用64次背景扫描，分辨率设置为8 cm?1（透射模式%）。FTIR光谱使用OriginLab?软件（版本2025b，SR1（No_H_234）进行可视化和处理。

2.11 拉曼光谱
拉曼光谱用于评估Omega-3浓度最高的HDES提取物的结构组成。使用Renishaw InVia共聚焦光谱仪（英国格洛斯特郡Wotton-under-Edge）在200–3200 cm?1的光谱范围内获取拉曼光谱。激发光源为红色激光（633 nm），功率设置为100%（17 mW），曝光时间为20秒[31]。拉曼光谱使用OriginLab?软件（版本2025b，SR1（No_H_234）进行可视化和处理。

2.12 统计分析
所有结果均以平均值±标准偏差的形式报告。采用全因子实验设计（DOE）来评估氢键受体（HBA：薄荷醇或桉树脑）、摩尔比（MR：1:1、1:2和2:1）以及提取时间（ET：30分钟和60分钟）对Omega-3和粘度的影响。每个响应变量均独立进行分析。实验数据使用Minitab?软件（版本18）进行方差分析（ANOVA），置信水平为95%（p < 0.05），以确定因子效应及其交互作用对响应变量的统计显著性。此外，还应用Fisher最小显著差异（LSD）检验对不同处理之间的均值进行事后比较。

由于冻干过程中提取物量有限（产率为11.23%），所有实验均重复进行两次；统计分析考虑了这一重复次数。因此，显著效应和交互作用的识别仅表明在评估条件下的趋势。这种方法允许识别处理之间的相似模式，同时承认统计处理的局限性。对于脂肪酸谱分析，采用简化因子设计（2 × 2），考虑HBA（薄荷醇或桉树脑）和MR（1:1和1:2）作为因子。这些数据按照上述相同的统计方法进行分析。

3. 结果与讨论
3.1 HDES提取物的粘度
HDES的流动行为如图1所示，平均粘度值及其在剪切率10 s?1下的标准偏差总结在图2中。HDES提取物的粘度范围为0.011至0.036 Pa·s，在分析范围内表现出牛顿流体行为。由于研究因素（氢键受体（HBA）、HBA:HBD摩尔比（MR）和提取时间（ET）的影响，处理之间存在显著差异（p < 0.05）。

图1. 从Octopus maya副产品中获得的HDES提取物的粘度与三文鱼油的粘度比较，其中（a）表示含薄荷醇的提取物的粘度行为；（b）表示含桉树脑的提取物的粘度行为。
图2. 在剪切率10 s?1下，HDES副产品的粘度（单位为Pa·s）：M表示薄荷醇；E表示桉树脑；O表示油酸。HBA:HBD的摩尔比为……。数值表示为平均值±标准偏差（SD，n = 2）。不同字母表示统计显著差异（LSD，p < 0.05）。结果表明，含桉树脑的HDES提取物（HBA/O(MR)ET）的粘度低于含薄荷醇的HDES提取物（p < 0.05）。含桉树脑的配方EO(1:2)30和EO(1:2)60的粘度分别为0.023 ± 0.002 Pa·s和0.021 ± 0.001 Pa·s，是含桉树脑HDES中粘度最高的。含薄荷醇的配方EO(2:1)30和EO(2:1)60的粘度最低，分别为0.011 ± 0.002 Pa·s和0.012 ± 0.001 Pa·s。相比之下，含薄荷醇的系统粘度较高（p < 0.05）。例如，MO(2:1)60、MO(2:1)30和MO(1:1)30的粘度范围为0.032至0.036 Pa·s。

进一步分析实验设计（表2）显示，HBA和MR之间的交互作用具有统计显著性（p < 0.05），表明HDES提取物的粘度行为可能受这些因素影响。

表2. 氢键受体（HBA）、摩尔比（MR）以及UAE时间（ET）对响应变量的影响；它们双交互作用和三交互作用在95%置信水平（p < 0.05）下的效应。
与这些观察结果一致，交互作用图（图3a）显示，在摩尔比为2:1时，薄荷醇倾向于使HDES系统的粘度增加。相比之下，相同摩尔比的桉树脑则使系统粘度降低。这些趋势与Adeoye等人[32]的研究结果一致，他们评估了在固定摩尔比（1:1）下含薄荷醇和脂肪酸的纯HDES的粘度。在那项研究中，粘度的增加与脂肪酸的烷基链长度相关。报告的粘度分别为辛酸（C8:0）0.012 Pa·s、癸酸（C10:0）0.016 Pa·s和十二酸（C12:0）0.018 Pa·s。然而，那些作者是在纯HDES状态下进行表征的，没有经过提取过程。在这种情况下，含桉树脑系统的粘度相似，而含薄荷醇系统的粘度较高（≤0.037 Pa·s），这一效应归因于油酸（C18:1）中的碳原子数量和HBA系统的固有粘度（ηmenthol > ηeucalyptol）。

图3. 2 × 3 × 2全因子设计评估氢键受体类型（HBA：薄荷醇或桉树脑）、摩尔比（MR：1:1、1:2、2:1）和提取时间（ET：30分钟、60分钟）对粘度均值的影响的交互作用和主效应图。（a）HBA × MR；（b）HBA × ET。
另一方面，Dabbagh等人[33]报告称氢键相互作用对HDES的粘度有重要影响。他们的研究基于分子动力学模拟，考察了由脂肪酸（戊酸、庚酸和壬酸）作为氢键供体（HBD）和薄荷醇作为氢键受体（HBA）组成的HDES配方的分子性质，研究了三种HBD:HBA摩尔比（1:2、1:1和2:1）。模拟结果表明，增加脂肪酸的摩尔比例会导致粘度降低。这种行为归因于脂肪酸和薄荷醇之间分子间相互作用网络的变化。这一发现与本研究中含薄荷醇的HDES提取物的实验观察结果一致，其中较高的油酸含量（1:2）导致较低的粘度（0.027–0.029 Pa·s），而较低的油酸含量（2:1）导致较高的粘度（0.032–0.036 Pa·s）。这些相似性表明，由HDES组分的分子结构引起的分子间氢键相互作用是控制粘度行为的关键因素。在这种情况下，粘度可能与溶剂和溶质之间的传输能力有关，如Trenzado等人[21]所述。高粘度系统倾向于限制分子流动性，从而限制介质内的扩散速率。较低的粘度，通常与较短的链长度和/或HDES系统中脂肪酸的较高摩尔比例相关[32,33]，可能有助于溶剂渗透到生物基质中并增强质量传递。然而，HDES系统的提取效率受粘度的影响，还受传输现象和分子相互作用的影响。除了粘度外，溶剂极性、氢键能力和溶质-溶剂亲和力等因素也对提取性能至关重要。溶剂与目标脂质化合物之间的热力学相容性影响它们的溶解度，而质量传递则控制着它们从生物基质中的释放[34]。在分子层面上，氢键网络影响粘度，并有助于溶剂与溶解的脂质化合物相互作用，以及破坏基质的结构成分。因此，含有较高摩尔比例脂肪酸（橄榄油酸）的配方由于其较低的粘度，可能促进溶剂与基质的更好相互作用，从而提高多不饱和脂肪酸（PUFAs）的回收率。此外，所有HDES提取物都表现出牛顿流体行为（图1），粘度低于0.04 Pa·s，这表明它们具有良好的流动特性，有助于在基质内传输溶剂并促进提取过程。然而，考虑到实验是重复进行的，这些结果应被视为指示性趋势，而非决定性证据。

3.2. HDES提取物中的ω-3当量（UV–Vis）通过UV–Vis分光光度法（基于官能团对光的吸收，从而间接估计不饱和化合物）[35]分析从Octopus maya副产品中获得的HDES提取物中的ω-3当量（EO3），不同处理组之间存在显著差异（p < 0.05）（图4）。配方EO(1:1)30显示出最高的EO3值（0.83 ± 0.15 mg/mL）。然而，与其他桉树醇基处理组相比没有显著差异，后者的EO3值在0.66至0.70 mg/mL之间，表明这些配方的提取性能相似。总体而言，所有薄荷醇基HDES的EO3值较低（0.4 < EO3 mg/mL < 0.70）。图4. 通过UV-Vis分光光度法评估的Octopus maya副产品HDES提取物中的ω-3当量（mg/mL）。M = 薄荷醇；E = 桉树醇；O = 橄榄油酸；在不同HBA:HBD摩尔比下。数值表示为平均值±标准差（SD，n = 2）。不同的字母表示统计学上的显著差异（LSD，p < 0.05）。在解释这些结果时，需要考虑所使用分析方法的范围和局限性。正如Oliveira等人[29]报道的，UV–Vis分光光度法已被用于估计Tambaqui（Colossoma macropomum）新鲜组织中与脂肪酸（ω-3、ω-6和ω-9）相关的不饱和键。在本研究中，该方法专门用于估计ω-3当量。因此，本研究获得的数值反映了不同处理组在不饱和相关化合物中的相对差异，而不是ω-3脂肪酸的直接量化。在此背景下，实验设计允许评估氢键受体（HBA）、摩尔比（MR）和提取时间（ET）等因素对这些相对响应的影响。

在分析实验设计后，一个三重交互作用（HBA × MR × ET）和两个双重交互作用（HBA × MR）和（HBA × ET）对从Octopus maya副产品中获得的HDES提取物的EO3显示出显著影响（p < 0.05）（表2）。HBA × MR和HBA × ET的交互作用效果在图5中展示，连同MR × ET的交互作用和主效应图一起。然而，这些结果是基于有限的重复次数（n = 2）进行解释的，这可能会影响统计分析的敏感性。图5. 2 × 3 × 2全因子设计评估氢键受体类型（HBA: M = 薄荷醇，E = 桉树醇）、摩尔比（MR: 1:1, 1:2, 2:1）和提取时间（ET: 30 min, 60 min）对HDES提取物中ω-3当量（mg/mL）平均产量的影响：(a) MR × HBA (b) ET × HBA; (c) MR × ET 和 (d) 每个单独因素对HDES提取物中EO3（mg/mL）的主效应，通过UV-Vis分光光度法确定。三重交互作用表明HDES的组成（HBA/HBD）、摩尔比和提取时间显著影响EO3的回收率。关于HBA × MR交互作用（图5a），当桉树醇的摩尔比为1:1时，EO3值最高（0.83 ± 0.15 mg/mL），表明在所评估的参数下条件有利。对于HBA × ET交互作用（图5b），桉树醇在30分钟UAE时显示出较高的值，而薄荷醇则显示较低的值，表明受体之间可能存在时间依赖性行为。在MR × ET交互作用（图5c）中，摩尔比1:2结合30分钟UAE导致EO3值较高。最后，主效应图（图5d）显示基于桉树醇的系统倾向于显示较高的EO3值。此外，摩尔比1:2似乎在所有MR水平下都是最有利条件，而提取时间30分钟比60分钟更能产生较高的EO3值。总体而言，这些发现表明HDES的组成（HBA/HBD）对所得EO3值有显著影响。在这种情况下，观察到的桉树醇基和薄荷醇基系统之间的差异可能与HBA的分子结构有关。桉树醇或1,8-桉叶油烯（1,3,3-三甲基-2-氧杂环[2.2.2]辛烷）是一种单萜，具有刚性和紧凑的双环结构，主要由碳和氧原子组成，缺乏-OH基团。这一特性阻止了氢键的形成，限制了分子间相互作用，并使其熔点较低，能够在室温下保持液态[36]。这些结构特征可能影响最终HDES的理化性质。

相比之下，薄荷醇（2-异丙基-5-甲基环己醇）是一种含有羟基（-OH）的环状单萜，能够形成氢键。这些相互作用有利于分子间网络的形成，在纯态下导致稳定的结晶结构。然而，当薄荷醇与另一种成分（如脂肪酸）混合时，其熔点降低，形成粘度较高的稳定液体[37]。在本研究中，使用桉树醇基HDES获得的最高EO3值对应于最低的粘度值（0.012–0.023 Pa·s），而薄荷醇基配方（0.027–0.036 Pa·s）则显示出较低的EO3值和更大的变异性（0.41–0.70 mg/mL）。尽管较低的粘度可能有利于溶剂的移动性并促进与脂质基质的更好相互作用，从而可能提高提取能力[21]，但它不应被视为控制该过程的唯一因素。从这个意义上说，观察到的较低粘度（η薄荷醇 > η桉树醇）可能与较高的EO3值相关（EO3薄荷醇 = 0.41–0.70 mg/mL < EO3桉树醇 = 0.41–0.83 mg/mL），这表明这一性质可能对该行为有所贡献。相反，这种行为可能与分子结构、溶剂-溶质亲和力以及分子间相互作用的综合影响有关，还包括提取时间、HBA/HBD类型和摩尔比等处理参数，这些因素共同影响极性、氢键强度和粘度[38]。这些实验结果与Strieder等人[39]的报告相似，他们设计并表征了以桉树醇或橄榄油酸、十四醇、薄荷醇或樟脑作为HBD的HDES，用于从杏仁和花生奶副产品中回收脂肪酸。在他们的研究中，低粘度值（0.004–0.005 Pa·s）与脂肪酸的更好提取相关。此外，Bagovi?等人[40]也报告说薄荷醇倾向于形成更粘稠的HDES。在他们的研究中，他们配制了几种HDES以评估其理化性质，并发现薄荷醇-亚油酸和薄荷醇-百里酚的组合显示出更高的粘度（分别为0.027和0.029 Pa·s），而薄荷醇-樟脑和薄荷醇-辛酸的组合则没有。这些粘度值与本研究中薄荷醇基HDES的值相似，后者也显示出最低的EO3值。因此，本研究提供了补充的实验证据，表明HDES系统中的提取行为源于多种理化性质的综合作用和相互依赖性，而不仅仅是单一参数。尽管较低的粘度可能有利于溶剂的移动性，但EO3的值反映了粘度、溶剂-溶质亲和力和系统内分子间相互作用的整体相互作用。与此观察一致，统计分析表明HDES的组成，特别是氢键受体（HBA）及其摩尔比，以及提取时间，影响了所得到的EO3值。这些结果强调观察到的行为不是由单一变量控制的，而是由配方条件和处理的综合相互作用效应造成的。

基于UV–Vis分光光度法测得的最高EO3（mg/mL）值，选择用于傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱和脂肪酸分析的HDES提取物是MO(1:1)30、MO(1:2)30、EO(1:1)30和EO(1:2)30。由于所选样品具有相同的提取时间，因此应用了2 × 2因子设计，评估的因子是氢键受体（HBA：薄荷醇或桉树醇）和摩尔比（MR：1:1或1:2）。

3.3. Octopus maya副产品HDES提取物的FTIR和拉曼表征选定的HDES提取物MO(1:1)30、MO(1:2)30、EO(1:1)30和EO(1:2)30的FTIR光谱在4000至500 cm?1的波长范围内测量。每个光谱被分为四个区域，以识别提取物的官能团和分子组成。此外，还获得了拉曼光谱以支持骨架结构内的键的识别。每种HDES的FTIR和拉曼光谱分别显示在图6和图7中。图6. 根据UV–Vis分光光度分析，具有最高ω-3当量（mg/mL）的30分钟HDES提取物的FTIR光谱。MO：薄荷醇–橄榄油酸；EO：桉树醇–橄榄油酸。每个峰上的数字对应于观察到信号的波数。图7. 根据UV–Vis分光光度分析确定的具有最高ω-3当量的30分钟HDES提取物的拉曼光谱。MO：薄荷醇–橄榄油酸；EO：桉树醇–橄榄油酸。每个峰上的数字表示检测到振动带的相应拉曼位移。用薄荷醇配制的HDES（MO(1:1)30和MO(1:2)30）在3600–3100 cm?1区域显示出宽峰，这对应于薄荷醇的–OH伸缩振动[32,41]，尽管羧酸也可能显示这种振动。相比之下，在基于桉树醇的HDES中未检测到这种宽峰，这可以归因于桉树醇分子中没有羟基[36]。Strieder等人[39]也报告了类似的现象，他们在薄荷醇基HDES中观察到3383 cm?1处的宽峰，而在桉树醇–橄榄油酸配方中未检测到该区域的伸缩带。另一方面，FTIR光谱中通过3010 cm?1处的明确伸缩峰识别出HDES提取物中的不饱和键，对于MO(1:1)30、MO(1:2)30和EO(1:2)30而言；对于EO(1:1)30则是2998 cm?1。这些峰对应于–CH=CH–双键（不对称伸缩），可能与HDES系统中的不饱和脂肪酸ω-3、ω-6、ω-9或HBD中的橄榄油酸有关[42]。这些信号在拉曼光谱中得到证实，后者显示了3012–3008 cm?1的伸缩带（–C=C–H）、1657–1658 cm?1的变形带（C=C）和1271–1273 cm?1的变形带（=C–H），与ω-3脂肪酸的存在相关[43,44]。这些峰可能归因于HDES从Octopus maya副产品中回收的化合物，因为Adeoye等人[32]研究了基于薄荷醇和短链脂肪酸的HDES，以及Strieder等人[39]研究了基于桉树醇和橄榄油的HDES，他们的FTIR光谱中没有报告这些波数的带。需要注意的是，这些研究分析的是未经后续提取过程的纯HDES。

同时，饱和脂肪在FTIR光谱中对应于2920和2852 cm?1处的明确峰（–CH3）[41]，这一点通过拉曼光谱中2932和2852 cm?1处的强度得到了证实[44]。这些高强度带可能与橄榄油的存在有关，因为其烷基链主要由饱和键组成，这与GC分析（第3.4节）中获得的脂肪酸谱型一致，在提取物中也检测到了饱和脂肪酸。这种行为与用脂肪酸配制的HDES报告的结果一致。Adeoye等人[32]在2840至3000 cm?1区域内识别出与烷烃C–H键相关的伸缩带。他们的研究指出，在2840至3000厘米^-1的波数范围内观察到的位移和强度变化，是由脂肪酸的羧基（–COOH）中的氢与薄荷醇的羟基（–OH）中的氧之间的氢键相互作用引起的，从而形成了HDES。这一发现可以解释在2850至3000厘米^-1区域出现明显峰的原因，也可能与油酸和薄荷醇或桉叶醇之间的相互作用有关。在傅里叶变换红外（FTIR）光谱中还识别出另一个官能团——羰基（–C=O），它在1707–1709厘米^-1范围内显示出明确的吸收带。这些吸收带通常与脂质和脂肪酸或游离脂肪酸相关[42]。在基于桉叶醇的HDES的拉曼光谱中，观察到C=O波数的位移，这可能与ω-3酯的存在有关[44]。然而，Strieder等人[39]报告称，在含有桉叶醇和油酸的HDES的FTIR光谱中，1700–1710厘米^-1范围内的伸缩带也可能是由于HDES组分之间的氢键形成的结果。类似地，Adeoye等人[32]观察到，短链脂肪酸的FTIR光谱在1707厘米^-1处显示出一个C=O伸缩带，这表明与脂肪酸的分子间相互作用有关；当分析基于薄荷醇和短链脂肪酸的HDES时，该伸缩带移动到了1710厘米^-1。本研究中也观察到了类似的行为，即基于薄荷醇和桉叶醇的HDES在这一光谱区域显示出明确的C=O吸收带。这表明油酸中的羰基得以保留，并且参与了HDES系统内的相互作用。

3.4. Maya章鱼副产品的脂肪酸谱型
气相色谱（GC）是一种可靠且广泛使用的脂肪酸分析技术，因为它能够分离并准确量化单个化合物，被认为是脂质表征的参考方法。相比之下，UV-Vis只能间接估计不饱和化合物的含量，而无法区分复杂混合物中的特定脂肪酸[35,45]。因此，HDES的ω-3提取能力的解释得到了通过GC获得的脂肪酸谱型的支持，该谱型鉴定了以下脂肪酸：C16:0（棕榈酸）、C18:0（硬脂酸）、C18:1 n-9（油酸）、C18:2 n-6（亚油酸）和C18:3 n-3（α-亚麻酸）。
使用HDES和传统方法（COE）从Maya章鱼副产品中获得的脂肪酸谱型的平均值和标准差（以百分比表示）总结在图8中，每种脂肪酸组之间观察到了显著差异（p < 0.05）。这些结果允许直接比较传统提取（COE）和HDES系统在脂肪酸组成方面的差异。根据基于GC结果的HDES提取物的实验设计分析，氢键受体与摩尔比（HBA × MR）之间的相互作用对ω-3含量有显著影响（p < 0.05），突显了HDES组分间的分子间相互作用对提取性能的潜在影响。交互作用图（图9a）显示，在1:1的摩尔比下，薄荷醇的ω-3回收率最高（1.25%）。尽管这些结果在不同处理之间显示出一致的趋势，但在解释时应考虑到实验重复次数的限制。

图8. Maya章鱼副产品HDES提取物及传统方法（相应GC色谱图见图10）中的脂肪酸谱型（以百分比表示）。数值为平均值±标准差（SD，n = 2）。不同字母表示各脂肪酸组之间存在统计学上的显著差异（LSD，p < 0.05）。注：C16:0（棕榈酸）；C18:0（硬脂酸）；C18:1 n-9（油酸）；C18:2 n-6（亚油酸）；C18:3 n-3（α-亚麻酸）。
图9. 交互作用图（HBA × MR）显示氢键受体和摩尔比对（a）ω-3、（b）ω-6和（c）ω-9含量（%）在Maya章鱼副产品HDES提取物中的影响。
图10. 从Maya章鱼副产品（MO 1:1 30, MO 1:2 30, EO 1:1 30, 和 EO 1:2 30；命名如表1所定义）和传统油提取（COE）获得的HDES提取物的脂肪酸谱型：GC色谱图。总体而言，从副产品中获得的HDES提取物的ω-3 GC值介于1.02%至1.25%之间，这与α-亚麻酸（ALA，C18:3 n-3）的水平一致，表明HDES回收的主要是这种脂肪酸。这种行为表明HDES倾向于选择性地提取短链多不饱和脂肪酸，而对长链ω-3化合物（如EPA和DHA）的亲和力较低，可能是由于溶剂-溶质相互作用的立体和结构限制[34]。
从补充的角度来看，UV-Vis光谱分析显示基于桉叶醇的体系中ω-3等值的含量较高（0.83 mg/mL）。这种行为可能是由于在该波长下非特异性地检测到了不饱和化合物，反映了整体的不饱和程度而不是实际的ω-3含量。因此，在基于桉叶醇的体系中观察到的更高UV-Vis响应可能反映了不饱和化合物的总体存在，并不一定意味着ω-3脂肪酸的更高回收率[35]。在这种情况下，GC结果提供了更准确的提取行为表示，表明基于薄荷醇的体系实现了更高的ω-3回收率（1.23–1.25%）。
基于GC的结果，这种行为表明氢键受体（HBA）的分子结构影响了体系的提取性能。桉叶醇缺乏羟基，形成的分子间相互作用较弱，导致粘度较低（0.011–0.023 Pa·s），扩散能力提高，但选择性溶解特定脂肪酸的能力降低[36]。相比之下，薄荷醇含有能够形成氢键的羟基（–OH），促进了更强的分子间相互作用和更有序的溶剂网络[37]。尽管这导致粘度升高（0.027–0.036 Pa·s），但它可能增强了与脂质分子的特异性相互作用，有利于GC检测到的ω-3脂肪酸的提取。
Anstiss等人[24]报告称，含有薄荷醇–利多卡因的HDES有利于从贻贝（Perna canaliculus）中回收ω-3脂肪酸（EPA和DHA）。作者将这种行为归因于HDES与ω-3脂肪酸之间的分子亲和力，除了它们的疏水性外，这些脂肪酸还含有能够参与氢键形成的羧基。在这种情况下，能够促进分子间相互作用的功能基团的存在似乎在增强溶质-溶剂亲和力和因此提取选择性方面起着关键作用，超出了单纯运输性质的影响[34]。此外，Topal等人[25]指出，HDES对脂肪酸的亲和力取决于HDES体系组分与目标脂质的性质之间的相互作用。他们的研究表明，基于薄荷醇的体系（薄荷醇–香芹酚和薄荷醇–百里酚）在富含中性脂肪（三酰甘油和甾醇）的鱼类中显示出良好的总脂质提取能力，但在富含极性脂质（磷脂）的贻贝中效率较低。这种行为归因于这些HDES的非极性特性，限制了它们对极性脂质化合物的亲和力。这些发现与本研究的结果一致，表明提取效率受到溶剂极性、氢键能力和分子间相互作用的综合影响。这表明适当选择HDES组分对于提高提取能力和针对特定脂质组分的选择性至关重要。在这种情况下，也观察到了其他多不饱和脂肪酸的明显选择性行为[38]。
另一方面，传统提取（COE）显示的ω-3含量显著高于HDES提取物（19.95 ± 0.78%）。COE中的这一部分主要由长链ω-3脂肪酸组成，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和α-亚麻酸（ALA，C18:3 n-3）[46]。后者的值为0.05%，表明大约19.9%主要对应于EPA和DHA，而DPA（二十二碳五烯酸，C22:5 n-3）的比例较低，因为根据Torrinha等人的研究[6]，这种脂肪酸在Maya章鱼中的含量非常少（4.3 mg/100 g C22:5 n-3）。
从比较的角度来看，传统乙醇提取（COE）和HDES体系在GC ω-3回收率方面表现出明显不同。虽然COE显示出较高的总ω-3百分比，主要与长链脂肪酸（如EPA和DHA）相关，但HDES提取物的ω-3值范围较窄（1.02–1.25%），主要对应于α-亚麻酸（ALA）。这种对比表明，HDES体系可能根据目标化合物的分子特性表现出更选择性的提取，这可能会限制在高组成条件下（HBA:HBD）高价值化合物（如EPA和DHA）的回收。因此，尽管HDES在总ω-3产量方面不优于传统提取，但它们可能在选择性和调整提取条件方面具有优势。
除了ω-3脂肪酸外，分析还发现氢键受体与摩尔比（HBA × MR）之间的相互作用对ω-6值有显著影响（p < 0.05）。这些结果表明HDES组成有利于这些脂肪酸的更好回收。交互作用图（图9b）显示，在1:2的摩尔比下，基于薄荷醇的配方显示出最高的ω-6提取率（27.91%），对应于亚油酸（C18:2 n-6），表明这是HDES提取物中ω-6组的主要组成部分。相比之下，COE提取物的C18:2 n-6含量较低（0.55 ± 0.2%），但ω-6的总百分比较高（19.95 ± 0.78%），反映了ω-6脂肪酸如亚油酸、γ-亚麻酸（GLA）和花生四烯酸（AA）的存在[46]。这种化合物分布的差异表明，虽然传统方法能够更广泛地提取ω-6组分，但HDES体系倾向于选择性地浓缩特定组分，这一趋势在ω-3提取中也观察到。
这种行为可能归因于HDES组分与亚油酸以及亚油酸和α-亚麻酸之间的分子兼容性，它们的结构特征（链长和不饱和度）有利于与溶剂体系的范德华力和氢键作用[34]。特别是OH基团的存在[37]可能促进了这些脂肪酸的优先溶解。总体而言，这些发现突显了HDES实现特定ω-6和ω-3脂肪酸靶向提取的能力。
因此，这种选择性行为对于高价值脂质的靶向回收具有重要意义，表明可以根据不同的应用需求设计HDES来优先提取特定的多不饱和脂肪酸。另一方面，油酸（C18:1 n-9）在HDES提取物中占主导地位，这是因为它是溶剂配方的主要成分。相比之下，使用传统方法（COE）获得的提取物中油酸含量为3.87 ± 0.59%，接近Gullian等人[47]在使用传统提取方法分析Maya章鱼脂肪酸谱型时报告的值（5.74% C18:1 n-9）。尽管如此，基于薄荷醇和桉叶醇的体系（HBA × MR）之间观察到的显著差异（p < 0.05）表明HDES组成影响了提取物中油酸的最终比例。在这方面，基于薄荷醇的体系（摩尔比1:1和1:2，图9c）显示出更高的油酸含量（60.55%），这可能与薄荷醇通过羟基（–OH）建立更强分子间相互作用的能力有关[36,37]。
最后，使用传统方法（COE）获得的饱和脂肪酸（棕榈酸，C16:0和硬脂酸，C18:0）的值显著高于HDES提取物（分别为19.16 ± 0.49%和15.55 ± 0.12%），而HDES提取物中的含量范围为6% < C16:0 < 8%和2% < C18:0 < 3%。根据实验设计分析，HBA的类型有显著影响（p < 0.05），其中薄荷醇在这些体系中显示出最高的饱和脂肪酸比例。这种行为可以归因于这些化合物的极性较低且缺乏反应活性位点，这限制了它们与氢键网络以及HDES（疏水深共晶溶剂）的结构组织的相互作用[36]。因此，这些化合物的回收率较低既反映了系统的物理化学限制，也表明溶剂对这些脂质（棕榈酸和硬脂酸）的亲和力较低。从比较的角度来看，这些结果表明，与传统方法不同，HDES限制了饱和脂肪酸的提取。从选择性角度来看，这一特性可能是有利的，特别是当目标是富集具有更高功能性或营养价值的脂质组分时[48]。

4. 结论
在本研究中，评估了由油酸与薄荷醇或桉叶醇组成的疏水深共晶溶剂（HDES）作为从Octopus maya副产物中提取和利用脂肪酸的替代系统，特别关注ω-3脂肪酸的回收情况。基于气相色谱（GC）的结果，观察到溶剂的组成，特别是氢键受体（HBA）的类型及其摩尔比（MR），显著影响不同脂肪酸组的回收率，表现出依赖于配方的提取行为。结果表明，HDES系统与乙醇相比具有不同的提取特性，它更倾向于选择性地提取特定化合物，而不是进行广谱提取。基于薄荷醇的配方有利于亚油酸（ω-6）的回收，而在较小程度上有利于α-亚麻酸（ω-3）的回收，而传统方法（COE）则实现了脂肪酸的总体较高回收率。这种对比表明，在评估的条件下，HDES并不最大化ω-3脂肪酸的总回收率，而是可以调整所得脂质组分的比例，反映了其选择性行为。这种选择性可能与溶剂系统与目标化合物之间的分子兼容性有关，这通过HDES中的HBA和MR来实现。因此，当目标是选择性回收特定脂质组分而非彻底提取时，HDES可以被视为一种可行的选择。然而，这也意味着提取效率取决于脂肪酸的化学性质。因此，要提高长链ω-3脂肪酸（EPA和DHA）的回收率，需要进一步优化溶剂设计以增强其亲和力和溶解性。

值得注意的是，由于重复实验次数有限，对ω-3脂肪酸回收率的解读主要依赖于GC数据，而紫外-可见光谱（UV–Vis）结果仅作为相对趋势的补充指标，因为后者具有非特异性。未来的工作应重点研究HDES组成与脂肪酸选择性之间的具体关系，并优化所研究的参数（HBA类型、摩尔比、UAE时间）。为海洋副产物中的脂质回收设计HDES可能能够选择性提取欧米伽脂肪酸，这对食品行业来说很有吸引力，可以将其添加到食品基质中以提升营养价值或开发功能性食品。