通过氨基阻断的唾液酸连接特异性烷基酰胺化方法对唾液酸化糖蛋白进行定性和定量分析

《Analytica Chimica Acta》：Amino-blocking Sialic Acid Linkage Specific Alkylamidation for Qualitative and Quantitative Analysis of Sialylated Glycoproteins

唾液酸连接异构体特异性衍生化策略及在类风湿关节炎血清糖基蛋白组学研究中的应用

　　

罗万伟|田志新

上海工业大学化学科学与工程学院，上海化学评估与可持续性重点实验室，中国上海200092

摘要

蛋白质糖基化是一种关键的翻译后修饰，参与多种生理过程。唾液酸作为糖链末端单糖，具有重要的生物学功能，并与多种疾病相关，但由于其连接异构体（α2,3-与α2,6-）的质量相同且色谱行为相似，传统LC-MS/MS方法难以区分它们。尽管基于内酯环开解氨解的唾液酸连接特异性烷基化（SALSA）技术已广泛应用于糖肽研究，但在衍生化过程中仍观察到不希望发生的糖肽-糖肽缩合副反应。为克服这一限制，我们开发了一种新的SALSA策略：在SALSA衍生化之前，使用乙醛或其同位素标记版本（乙醛-¹³C₂）对糖肽进行还原性二乙基化处理，从而同时实现副反应的预防和定量同位素标记。通过两种标准糖肽和一种标准糖蛋白的实验验证，确定了最佳SALSA方案。结合稳定同位素二乙基标记技术，我们定量比较了梅毒患者和健康对照者的血清N-糖蛋白组，鉴定出106种差异表达的完整N-糖肽，包括α2,3-和α2,6-连接异构体。SALSA技术完美地实现了唾液酸化糖肽连接特异性衍生化中的副反应预防和定量同位素标记，因此可能在唾液酸化糖蛋白的定量连接特异性分析中得到广泛应用。

章节摘录

引言

糖基化是最常见的蛋白质翻译后修饰之一[1]，具有复杂的结构，对多种生物过程至关重要，如蛋白质折叠与稳定性[2]、细胞间粘附[3]和细胞通讯[4]；异常糖基化与多种病理状态密切相关，包括癌症[5]、[6]、[7]和传染病[8]、[9]。尽管已有大量研究揭示了其复杂机制……

实验部分

试剂。二甲基亚砜（DMSO，≥99.7%）、乙胺溶液（EA，66.0–72.0% H₂O）、2,2,2-三氟乙醇（TFE，≥99%）、三氟乙酸（TFA，99%）、甲酸（FA）、乙腈（ACN，≥99.7%）、乙醛（CH₃CHO，≥99.5%）、乙醛-¹³C₂（99原子% ¹³C）、氰硼氢化钠（NaBH₃CN，95%）、碘乙酰胺（IAA）和二硫苏糖醇（DTT）均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。1-羟基苯并三唑一水合物也来自Sigma-Aldrich。

结果与讨论

EDC/HOBt是常用的肽合成缩合试剂；然而，在唾液酸化糖肽的烷基化过程中，它可能促进肽间烷基化副反应。为解决这一问题，我们开发了一种两步衍生化方案，首先通过二乙基化阻断肽的氨基（图1）。使用两种标准糖肽进行方法优化和验证。第一步中，二乙基化修饰了N端和赖氨酸侧链的氨基。

结论

本研究提出了一种改进的衍生化策略aSALSA，将N端二乙基阻断与唾液酸连接特异性烷基化相结合。通过预先阻断肽的氨基，有效抑制了分子内缩合副反应，提高了唾液酸化糖肽的衍生化产率和检测灵敏度。系统优化后，该策略在温和条件下对唾液酸（>95%）和肽羧基的衍生化效率较高。

作者贡献声明

罗万伟：撰写初稿、数据可视化、结果验证、软件使用、项目管理、方法设计、实验实施、数据分析、数据整理。田志新：审稿与编辑、数据可视化、结果验证、实验监督、资源调配、项目管理、方法设计、实验设计、资金争取、数据分析、概念构思

数据可用性

质谱数据已通过iProX合作伙伴仓库[43]，[44]存入ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD072001。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号22074105）和上海科学技术委员会（编号14DZ2261100）的财政支持。