通过免疫信息学技术开发针对类风湿性关节炎的创新多表位疫苗

《Human Immunology》：Innovative multi-epitope vaccine development for rheumatoid arthritis via immunoinformatics

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，现有疗法仅缓解症状。本研究设计了一种多表位疫苗，靶向RA关键致病分子TNF-α、IL-23R、PTPN22、PADI2和PADI4，结合Melittin和GP96佐剂，通过计算免疫学验证其安全性和免疫激活潜力。

　　

Azizeh ShadiDizaji、Farideh Ghalamfarsa、Kagan Tolga Cinisli、Gita Esmailnia、Ufuk OKKAY、Ahmet Hacimuftuoglu、Mustafa Erdem Sagsoz、Yousef Fazli、Ramin Jannesar、Mohamad Warda、Mesut Taskin

土耳其埃尔祖鲁姆阿塔图尔克大学疫苗开发应用与研究中心

摘要

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是持续的关节炎症、疼痛和进行性功能障碍，影响着全球数百万人。现有的治疗方法，包括抗炎药和免疫抑制剂，可以缓解症状，但无法实现长期的疾病控制或免疫耐受，这凸显了创新治疗策略的必要性。在这里，我们介绍了一种新型多表位疫苗，该疫苗利用免疫信息学技术设计，针对RA相关的关键分子——TNF-α、IL-23R、PTPN22、PADI2和PADI4——这些分子是炎症和自身免疫反应的主要驱动因素。该疫苗使用了Melittin和GP96作为佐剂，以增强免疫原性并降低毒性。通过全面的计算机模拟分析（包括表位预测、抗原性、致敏性和理化特性分析），确保了疫苗的安全性和有效性。分子对接和动力学模拟显示，该疫苗能与Toll样受体9（TLR9）稳定结合，表明其能够有效激活免疫系统。此外，计算克隆和密码子优化证实了该疫苗在细菌载体中的高表达潜力。计算机免疫模拟预测，该疫苗可引发Th1偏向的免疫反应，并促进B细胞记忆的形成，从而支持其调节RA中的病理免疫反应的能力。这项研究为多靶点免疫疗法提供了一个合理的框架，利用计算方法加速了疫苗的开发过程。虽然还需要实验验证，但这些发现为下一代RA疫苗奠定了基础，有望在多个层面上打破自身免疫的连锁反应，为疾病的长期管理提供新的途径。

引言

类风湿性关节炎（RA）是一种复杂的自身免疫性疾病，其特征是慢性滑膜炎症，导致关节逐渐破坏和全身性并发症，影响全球约1%的人口，给患者带来沉重的疾病负担[1]。与此同时，计算疫苗设计已广泛应用于传染病领域，许多研究针对登革热病毒、流感和SARS-CoV-2等病原体开发了多表位疫苗[2][3][4]。这些研究表明，免疫信息学方法在加速疫苗开发方面具有可行性，并强调了表位预测、结构建模和免疫模拟在合理设计中的重要作用。然而，尽管相关文献不断增加，但计算疫苗设计在自身免疫性疾病中的应用仍然有限。RA是一个独特的挑战，因为传统疗法难以诱导持久的免疫耐受。我们的研究通过应用免疫信息学技术，针对RA的关键致病蛋白（TNF-α、IL-23R、PTPN22、PADI2和PADI4）并整合新型佐剂（Melittin和GP96），试图解决这一难题。我们将这项工作置于更广泛的计算疫苗设计框架内，并重点关注自身免疫病理机制，旨在展示如何利用多表位结构来调节RA中的异常免疫反应，而非单纯清除病原体。

RA的发病机制涉及遗传易感性、环境触发因素和免疫反应失调之间的复杂相互作用，其中自身抗体的产生（如类风湿因子RF和抗瓜氨酸化蛋白抗体ACPA）起着关键作用[5]。这些自身抗体通过形成免疫复合物、激活补体以及持续引发炎症级联反应，最终导致软骨退化和骨骼侵蚀[6]。在自身抗体中，类风湿因子（RF）主要是针对IgG Fc区域的IgM抗体，在RA的发病机制中起着关键作用，它会在滑液中形成免疫复合物，触发补体激活、白细胞浸润和慢性炎症[7]。RF由B细胞在免疫刺激（如感染）下产生，在临床RA症状出现前几年即可检测到，与严重的疾病进展、更严重的关节损伤和关节外表现相关[8]。同样，抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）是在炎症过程中由钙依赖性肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD2和PAD4）介导产生的[9,10]。瓜氨酸化改变了蛋白质结构，在遗传易感个体中引发免疫反应，产生ACPA（IgG、IgA、IgM）。这些抗体，尤其是“私有”ACPA，会靶向关节蛋白，促进RA中的慢性炎症和骨骼侵蚀。研究表明，PAD4作为瓜氨酸化蛋白的载体，驱动ACPA的合成，从而在RA的发病机制中起作用[11]。除了自身抗体和治疗挑战外，遗传因素也对RA的发病机制有重要影响。PTPN22 R620W变异（rs2476601）通过破坏T细胞和B细胞信号的负调控机制，促进RA的发病[12]。研究表明，这种遗传变异与RA的发病风险相关，尤其是与血清阳性疾病相关。通常情况下，PTPN22编码的淋巴酪氨酸磷酸酶（LYP）与C末端Src激酶（CSK）形成复合物，抑制Src家族激酶（如Lck、Lyn）的活性，防止免疫细胞过度激活。然而，R620W突变会破坏这种相互作用，导致TCR和BCR信号过度活跃，降低T/B细胞激活的阈值，影响自身反应性淋巴细胞的清除。这会导致自身反应性T细胞和B细胞克隆的存活，增加自身抗体（如ACPA、RF）的产生，从而加剧炎症[13]。此外，该变异还会增强髓系细胞的激活，进一步促进滑膜炎症和关节破坏。这些机制解释了PTPN22与血清阳性RA的强相关性，以及它作为最重要的非HLA遗传风险因素的作用[14]。IL-23/IL-23R轴在RA的发病机制中也起着关键作用，通过驱动促炎级联反应和骨骼破坏发挥作用。IL-23由p19和p40亚单位组成，特异性结合巨噬细胞和T细胞上的IL-23R，激活IL-23/IL-17通路，促进Th17细胞的扩增和IL-17A/F、IL-22、TNF-α和GM-CSF等细胞因子的产生，这些细胞因子会维持滑膜炎症和关节损伤[15]。IL-23不仅激活Th17细胞，还通过上调T细胞中的RANKL表达和增加TRAP活性，直接促进破骨细胞的生成，从而加剧骨骼侵蚀[16]。RA滑膜纤维细胞和血浆中的IL-23水平升高与疾病活动相关，而IL-23R的基因变异与自身免疫易感性有关[17]。IL-23还能刺激炎症性巨噬细胞产生IL-1、TNF-α等细胞因子，形成自我放大的炎症循环[18]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在RA的发病机制中也起着关键作用，通过驱动炎症、滑膜增生和关节破坏发挥作用。作为主要的促炎细胞因子，TNF-α主要由激活的巨噬细胞、滑膜纤维细胞和T细胞产生，促进其他炎症介质（如IL-1β、IL-6、GM-CSF）的表达和黏附分子的生成，从而加剧炎症[19]。IL-23还通过抑制Treg细胞功能，促进Th1/Th17反应，进一步加剧自身免疫[20]。TNF-α存在可溶性（sTNF）和膜结合（memTNF）两种形式，其中sTNF主要通过TNFR1信号通路发挥作用，而memTNF-TNFR2相互作用可能在免疫调节中具有保护作用[21]。这种双重功能解释了TNF抑制剂在RA治疗中的疗效及其可能引发的矛盾性自身免疫反应[22]。鉴于针对TNF的疗法存在局限性，能够广泛增强免疫反应的佐剂提供了一种有前景的替代方案。GP96是一种来自HSP90家族的热休克蛋白，作为强效疫苗佐剂，可结合抗原肽并将其递送至抗原呈递细胞（APCs），同时通过与树突状细胞和巨噬细胞上的Toll样受体相互作用，刺激先天免疫反应，提高共刺激分子和细胞因子（如IL-12、TNF-α）的分泌，从而增强适应性免疫反应，包括细胞毒性T细胞的激活[23]，使其在癌症免疫治疗和流感、肿瘤肽疫苗中具有价值[24]。Melittin是蜂毒的关键成分，具有免疫调节和抗炎作用，可能在治疗类风湿性关节炎等炎症性疾病中作为佐剂使用，但也因其溶血毒性而限制了直接应用，因此开发了纳米载体和融合蛋白来减轻毒性，同时保留其佐剂和抗炎特性[25][26]。

尽管自身抗体在RA中起着关键作用，但目前的治疗方法仍然不足。尽管针对特定细胞因子的生物制剂取得了治疗进展，但仍存在治疗反应不一、成本高昂和不良反应严重等问题，亟需新的治疗策略。免疫信息学的最新发展为通过计算预测免疫原性表位和合理设计疫苗提供了新的途径。这种方法利用生物信息学工具识别疾病相关自身抗原的潜在B细胞和T细胞表位，从而设计出能够调节病理免疫反应的多表位疫苗，同时减少脱靶效应。基于这些进展，计算预测发现了RA发病机制中关键蛋白（如TNF-α、IL-23R、PTN22、PADI2和PADI4）的潜在表位，并结合了Melittin和GP96佐剂。针对这些表位的疫苗可能调节免疫反应，同时减轻RA相关的炎症过程。本研究通过计算机模拟设计了针对多种RA相关蛋白表位的新疫苗结构。通过分子对接、分子动力学模拟和生物信息学分析，我们发现了具有最佳结合亲和力和稳定性的表位。所选肽具有有利于有效疫苗接种的特性，包括高免疫原性、低致敏性和在RA相关致病变异中的高度保守性。通过采用这种方法，我们希望为计算免疫学领域的发展做出贡献，并推动RA个性化治疗的进步。这种计算设计的疫苗的实施有可能将治疗概念转化为更有效和更安全的RA和其他自身免疫性疾病治疗手段。

材料与方法

图1展示了新型多表位疫苗的设计流程图。方法部分详细介绍了该过程中的各个主要步骤。

表位筛选

疫苗结构由根据特定标准从TNF-α、IL-23R、PTN22、PADI2和PADI4蛋白中选择的十一个肽组成，同时还加入了Melitin和Endoplasmin（GP96）佐剂蛋白。这些肽显示出最高的IFN-γ诱导能力、低致敏性和强抗原性，并在大多数RA致病蛋白中保持保守[27]。

疫苗工程：理化性质、抗原性和致敏性的评估

为了增强免疫原性，将来自五种RA蛋白的选定肽结合在一起

讨论

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜炎症、自身抗体的产生和进行性关节破坏，影响全球约1%的人口[1][2][3][4][5][6][7][8]。其发病机制涉及遗传易感性、环境触发因素和免疫反应失调之间的复杂相互作用。关键分子介质（如TNF-α、IL-23R、PTPN22、PADI2和PADI4）在疾病发展中起着核心作用

结论

本研究设计了一种多表位疫苗，针对RA发病机制中的关键致病分子——TNF-α、IL-23R、PTPN22、PADI2和PADI4。全面的计算分析确定了具有高抗原性的最佳B细胞、辅助T细胞和细胞毒性T细胞表位，同时表现出最低的致敏性和毒性。该疫苗结构具有良好的理化性质，包括溶解性、热稳定性和

作者贡献声明

Azizeh ShadiDizaji：撰写原始稿件、可视化、验证、软件开发、方法论设计。Farideh Ghalamfarsa：撰写原始稿件、验证、软件开发、方法论设计、实验研究。Kagan Tolga Cinisli：可视化、验证、资源协调、形式分析。Gita Esmailnia：软件开发、方法论设计、实验研究。Ufuk OKKAY：实验研究、数据管理、概念构思。Ahmet Hacimuftuoglu：撰写、审稿与编辑、监督。Mustafa Erdem Sagsoz：软件开发。Yousef Fazli：

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。