《International Journal of Biological Macromolecules》：Structure-function guided design of sequential whey protein-polyphenol-pectin conjugates for enhanced lutein stability and controlled bioaccessibility
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高效叶黄素递送系统通过乳清蛋白与果胶及多酚的共价交联策略构建，采用美拉德反应和碱催化驱动形成二元及三元复合物。研究发现，WP-TA-PE三元复合物乳化稳定性指数提升94%，兼具抗氧化保护与缓释特性，但生物可及性低于天然乳清蛋白。交联顺序对功能调控起关键作用：先形成蛋白-多酚共价键再与果胶结合的三元系统，在物理稳定性和抗氧化性方面优于传统二元复合物，但需在生物利用度与稳定性间权衡。
梅萨姆·科米贾尼（Meysam Komijani）| 阿里·阿加卡尼（Ali Aghakhani）| 戈拉姆雷扎·阿斯卡里（Gholamreza Askari）
伊朗卡拉杰（Karaj）德黑兰大学（University of Tehran）农业与自然资源学院（College of Agriculture and Natural Resources）食品科学、工程与技术系（Department of Food Science, Engineering and Technology）
摘要
开发高效递送系统以输送像叶黄素这样的亲脂性生物活性物质仍然是一个重大挑战。本研究通过美拉德反应（Maillard reaction）和碱性驱动的结合方式，将乳清蛋白（Whey Protein, WP）与果胶（Pectin, PE）及多酚（没食子酸，Gallic Acid, GA；单宁酸，Tannic Acid, TA）结合，制备了一系列二元和三元复合物，从而创造出定制的叶黄素载体。综合表征（SDS-PAGE、FTIR、荧光分析）证实了共价键的成功形成，其中顺序双共价结合（WP-GA/TA-PE）显著减少了游离氨基和巯基团的数量。特别是WP-TA-PE这种双共价复合物表现出优异的乳化性能（乳液稳定性指数提高了约94%），这得益于共价交联和多糖包覆的协同作用。这种结构为叶黄素提供了强大的多方面保护机制：实现了最高的紫外线稳定性、热稳定性和储存稳定性。此外，这些复合物还控制了叶黄素的消化过程，其中WP-TA-PE显示出最低的游离脂肪酸释放量和最佳的生物可利用性，表明其具有很强的屏障功能。相反，天然乳清蛋白（native WP）由于易于消化的特性，提供了最高的叶黄素生物可利用性。一个关键的结构-功能发现是：结合途径的不同导致了明显的权衡：共价多酚结合物（WP-GA/TA）是最优的抗氧化剂，而顺序双共价结合物（WP-GA/TA-PE）则是更优秀的乳化剂和保护剂，尽管其生物可利用性有所降低。这项工作展示了一种合理的设计策略，用于创建具有可调性能的多功能食品级胶体系统，以应用于强化食品和补充剂中。
引言
叶黄素是一种不饱和类黄酮类胡萝卜素（含氧的胡萝卜素），主要存在于黄橙色水果、深绿色叶类蔬菜、万寿菊、玉米和鸡蛋中。作为一种人体无法内源性合成的必需营养素，叶黄素必须通过饮食或补充剂获取[1]。尽管叶黄素具有许多已证实的健康益处，但在食品系统中的实际应用仍面临诸多挑战，包括其水溶性差、生物可利用性有限，以及在热、光和氧化等环境压力下容易降解[2]。大量流行病学和临床研究表明，叶黄素对多种慢性疾病具有保护作用，尤其是在降低心血管疾病、皮肤炎症和年龄相关性黄斑变性的风险方面[3]。这些健康促进特性激发了人们开发有效递送系统的兴趣，以提高叶黄素的溶解性、稳定性和生物可利用性。在各种封装技术中，基于乳液的递送系统因能够提供高封装效率、优异的化学保护和可控的释放动力学而显得特别有前景[4]。
乳清蛋白（Whey Protein, WP）约占牛乳蛋白质的20%，是一类有价值的生物聚合物，可用于生物活性物质的递送。主要的乳清蛋白组分包括β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin, β-Lg）、α-乳白蛋白（α-Lactalbumin, α-La）、牛乳过氧化物酶（Lactoperoxidase, LP）、乳铁蛋白（Lactoferrin, BLF）、血清白蛋白（Serum Albumin, BSA）、免疫球蛋白（Immunoglobulins, Igs）和糖巨肽（Glycomacropeptides）[5]。乳清蛋白曾被视为乳制品行业的副产品，但由于其出色的安全性、环境可持续性、平衡的氨基酸组成以及多种功能特性（如乳化、凝胶化和泡沫稳定性），在食品应用中变得越来越重要[6]。然而，天然形式的乳清蛋白作为乳化剂存在局限性，在极端pH值、酶水解、热处理和高离子强度等条件下容易沉淀、聚集和变性[7]。
最新研究表明，通过与多糖和/或多酚的复合，可以显著改善乳清蛋白的功能性能[8]、[9]、[10]。二元蛋白-多糖复合物表现出增强的乳化性能和改性的消化特性，其中多糖成分增加了粘度，从而减缓了胃排空速度并实现了更可控的释放动力学[11]。在严格控制pH值、温度和湿度条件的情况下，美拉德反应可以为蛋白质和还原性碳水化合物之间创建稳定的共价结合[12]。果胶（Pectin, PE）是一种阴离子杂多糖，主要来源于植物副产品（柑橘皮、苹果渣和甜菜渣），在食品系统中可作为稳定剂、增稠剂和凝胶剂。除了技术应用外，果胶还显示出多种生理益处，包括抗炎、降血糖和降胆固醇作用[13]。研究表明，乳清蛋白与果胶之间的美拉德结合显著改善了乳化性能[14]。
类似地，乳清蛋白还可以通过与植物多酚（如没食子酸（GA）和单宁酸（TA）的共价和非共价相互作用形成二元复合物[15]。这些多酚的结构特征，特别是官能团的种类和数量，对其与乳清蛋白的相互作用性质和强度有着关键影响。
尽管这些二元复合物（无论是蛋白-多糖还是蛋白-多酚）在乳液稳定性和可控释放方面都表现出显著改进，但在同时保护高度敏感的生物活性物质（如叶黄素）时往往存在局限性[16]。具体来说，虽然多糖成分提供了良好的空间稳定作用，但二元系统可能缺乏防止封装脂质氧化降解所需的强效界面抗氧化活性。此外，单独的二元复合物可能不足以满足复杂的胃肠道压力下的多方面稳定性要求[17]、[18]。相比之下，三元复合物（Terpolymers）提供了一个独特的平台，可以结合三种成分的协同优势：蛋白质提供乳化作用，多糖确保空间和物理稳定性，多酚提供强大的抗氧化保护和界面强化。这种多组分策略有望克服二元系统的个别局限性，创造出具有更优稳定性和功能的递送系统。
基于这一原理，本研究旨在系统地阐明相互作用序列和机制的作用。我们通过两种不同的策略途径设计了三元系统：（i）顺序共价连接（WP-GA/TA-PE），即先进行碱性驱动的蛋白质-多酚结合，然后再进行美拉德反应；（ii）先进行共价美拉德结合，再通过非共价方式组装（（WP-PE）-GA/TA），即多酚随后通过非共价作用组装到预先形成的美拉德结合物（WP-PE）上。虽然没有将理想的三元物理混合物（WP + GA/TA + PE）作为单独的对照组，但通过比较共价结合物（例如CON（WP-PE）和WP-GA/TA）与其相应的物理混合物（MIX（WP/PE）以及天然蛋白质，阐明了共价键合的核心效应。具体目标是：（i）制备并表征这些二元和三元复合物；（ii）评估它们在稳定负载叶黄素的乳液方面对抗胃肠道和环境压力的效果。
材料
材料
乳清蛋白分离物（纯度90%）来自Hilmar Ingredients（美国加利福尼亚州Hilmar）。果胶（P9135），含有超过74.0%的半乳糖醛酸，购自Sigma–Aldrich（中国上海）。叶黄素（HPLC ≥90%）由湖南华康生物科技有限公司（中国上海）提供。单宁酸（100773）和没食子酸（842649）由Merck（德国达姆施塔特）提供。所有其他化学品均为分析级。
（WP-GA/TA）二元复合物的制备
（WP-GA/TA）二元复合物的制备方法如下
二元和三元结合物的SDS-PAGE表征
通过SDS-PAGE分析来阐明在不同反应条件下乳清蛋白（WP）与其他组分之间的共价结合情况（图1）。物理混合物WP/PE（MIX WP/PE）的电泳图谱与天然乳清蛋白几乎相同，证实了简单混合后没有共价相互作用，为后续比较提供了重要的非反应性基准。经过与果胶的美拉德反应后，乳清蛋白结合物（CON WP-PE）显示出明显的
结论
本研究建立了一系列工程化乳清蛋白基结合物的结构-功能关系，证明了它们作为叶黄素递送系统的有效性。一个关键的设计原则是：相互作用的序列和共价性质至关重要。具体来说，结合顺序（例如WP-GA/TA-PE与WP-PE-GA/TA）决定了物理稳定性和消化性之间的平衡，从而实现了针对特定应用的定制设计。
CRediT作者贡献声明
梅萨姆·科米贾尼（Meysam Komijani）：撰写——原始草稿、验证、软件使用、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。阿里·阿加卡尼（Ali Aghakhani）：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、方法学设计、实验研究、资金获取、数据整理、概念构思。戈拉姆雷扎·阿斯卡里（Gholamreza Askari）：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。
写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者仅使用“DeepSeek AI”（由DeepSeek开发）来“提高手稿的语言表达、清晰度和可读性”。使用该工具后，作者对内容进行了彻底审查和编辑，并对本文中呈现的所有科学内容、数据解释和结论负全责。
致谢
作者衷心感谢德黑兰大学（University of Tehran）研究生研究办公室对本研究的财政支持。同时，我们也感谢Homa Pars Darou制药公司慷慨提供本研究所需的叶黄素。
