《International Journal of Biological Macromolecules》：Discovery and mechanistic exploration of natural butyrylcholinesterase inhibitors via integrated virtual screening and multidisciplinary approaches
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选择性但yrylcholinesterase（BChE）抑制剂开发为阿尔茨海默病（AD）治疗新策略，通过虚拟筛选结合实验验证从60580种天然产物中鉴定出hirsutine、picrasidine I和T三种生物碱，IC50<10μM，揭示其混合型抑制机制及稳定结合界面，并证实其良好血脑屏障渗透性及低细胞毒性。
刘艳|刘毅|余德洪|杨灿|徐海琦|王娜|杜佳娜|李丽子|陈刚|刘泽荣|涂艳蓓|李彦芳
四川大学化学工程学院，成都，610065，中国
摘要 从天然来源开发选择性丁酰胆碱酯酶（BChE）抑制剂是发现阿尔茨海默病（AD）新疗法的战略前沿。我们采用了一套严格的层次化虚拟筛选方案，包括高通量筛选、集合分子对接以及MM/GBSA结合亲和力优化，系统地筛选了包含60,580种植物化学物质的天然产物库。这一计算流程最终确定了三种具有强效BChE抑制作用的生物碱候选物（hirsutine、picrasidine I和picrasidine T），其IC50值低于10 μM，并通过酶学实验得到了验证。详细的动力学表征进一步证实，hirsutine和picrasidine I是可逆的混合型抑制剂，它们同时作用于BChE的催化活性位点和外围芳香位点（PAS）。为阐明作用机制，选择picrasidine I进行了全面的光谱分析，包括分子荧光、时间分辨荧光、三维荧光、圆二色性（CD）和等温滴定量热法（ITC）。ITC分析显示picrasidine I与BChE之间的亲和力很强，解离常数为2.97 μM；荧光研究则表明其作用机制为静态猝灭。分子动力学（MD）模拟（50 ns）证实了配体-蛋白复合物的稳定性，其主链RMSD小于0.3 nm。此外，ADME预测表明这些抑制剂具有良好的血脑屏障（BBB）通透性，并且在PC-12神经元中表现出极低的细胞毒性。这种计算-实验协同方法不仅成功发现了新的强效BChE抑制剂及其精确的作用机制，还为理性发现和开发天然抗AD药物提供了实用且高效的战略。
引言 阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，是全球老年人痴呆的主要原因，其特征是认知能力下降、记忆丧失和行为障碍[1]、[2]。病理学上，AD表现为多种机制的综合作用，包括β-淀粉样蛋白斑块沉积、过度磷酸化的tau神经纤维缠结、氧化应激以及胆碱能神经传递功能障碍[3]、[4]。根据目前的流行病学数据，2019年AD病例数为5500万例，预计到2050年将增加到1.39亿例[5]。这一趋势凸显了开发有效治疗干预措施的迫切需求。
根据广为接受的胆碱能假说，AD的发病机制在于海马体和皮层乙酰胆碱（ACh）水平的降低，这导致患者出现严重的记忆和学习问题[6]。ACh主要由胆碱酯酶（ChEs）水解，包括乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）。在生理条件下，ACh主要通过AChE代谢，因此AChE抑制剂已成为AD治疗的基石。然而，AChE抑制剂的临床应用受到其副交感神经刺激副作用（如胃肠道紊乱）的限制，这影响了患者的依从性；而且在AD晚期，AChE活性急剧下降，几乎丧失了其水解功能[7]、[8]、[9]、[10]。相比之下，BChE活性逐渐增强，并在AD晚期成为主要的ACh水解酶[11]。哺乳动物体内存在多种形式的BChE，包括单体G1、G1-ALB复合物、二聚体G2和四聚体G4[12]。超过95%的天然BChE以高度糖基化的可溶性四聚体（G4）形式存在于血浆中，这种形式增强了BChE的稳定性。结构上，BChE与AChE有约65%的氨基酸序列同源性[13]。这两种酶在其活性位点都包含一个保守的催化三联体、一个胆碱结合口袋和一个酰基结合口袋[14]。与AChE不同，BChE在生理上并非必需，因此选择性抑制BChE是一种更安全的治疗策略，且副作用较小。值得注意的是，BChE在AD患者大脑中的β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块中的共定位表明，BChE的沉积与Aβ聚集之间存在正相关[15]。这些发现表明BChE是AD晚期的有希望的治疗靶点，选择性BChE抑制剂可能具有更强的疗效，同时能克服针对AChE的治疗方法的局限性[16]、[17]。
天然产物因其独特的结构多样性和生物功能复杂性，在AD药物研究中占据主导地位。大多数获批的AD治疗药物，如利凡斯的明、加兰他敏和石杉碱A，都来源于天然化合物[18]。寻找天然抗AD先导化合物的兴趣日益增加，因为这些天然化合物显示出显著的治疗效果、较低的不良反应和良好的生物利用度[19]。多种天然产物，包括lunasin、多酚、黄酮类、生物碱和单宁，被认为可能是新型或更有效的ChE抑制剂[18]、[20]、[21]、[22]。然而，需要注意的是，这些化合物大多主要针对AChE，而目前研究中从天然产物库中筛选BChE抑制剂的探索仍然不足。鉴于BChE在AD晚期的重要作用，筛选和开发具有高治疗潜力、新颖结构、良好ADME特性和低毒性的天然选择性BChE抑制剂具有重要意义。
在从植物界寻找天然BChE抑制剂的持续研究中，通过生物活性导向的分离策略，从多种药用植物中鉴定出了一些有前景的候选物[23]、[24]、[25]。然而，这种方法的缺点逐渐显现出来，因为它耗时且成本高昂。与传统的酶抑制剂发现方法相比，虚拟筛选是一种快速且经济的技术。分子对接是结构生物学和药物化学中的关键技术，用于预测小分子化合物与生物靶标（如蛋白质）的结合模式和亲和力[26]。该计算方法涉及将小分子“对接”到大分子靶标的三维结构中，并对其与结合位点的兼容性进行评分。它被广泛用于药物发现过程中的先导化合物识别和优化。值得注意的是，许多现代药物的进步在很大程度上得益于基于结构的设计和筛选策略，这突显了分子对接在合理药物设计中的重要作用[27]。已有文献记录了通过计算机辅助虚拟筛选鉴定选择性BChE抑制剂的多个成功案例[28]、[29]、[30]。
为此，本研究通过建立计算-实验协同范式（见图1），快速从天然产物库中鉴定BChE抑制剂。首先使用高通量筛选（HTS）模块过滤掉天然产物数据库中得分较低的分子。随后，结合精细的分子对接技术和MM-GBSA（分子力学/广义Born和表面积）计算，对候选化合物进行优先排序，以便进一步进行体外生物测定。通过动力学分析、多光谱评估和热力学实验，阐明了活性化合物的抑制机制。随后进行了分子动力学（MD）模拟（50 ns），以评估BChE-配体复合物的构象稳定性。此外，还通过计算机模拟评估了这些化合物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性，包括预测的血脑屏障（BBB）通透性，以确认其类似药物的特性。这种协同范式将计算预测与可靠的生物物理验证无缝结合，为天然BChE抑制剂的发现建立了高效的方法框架。
数据库和蛋白质的制备 来自台湾的TCM数据库（TCM Database@Taiwan）包含了60,580种天然产物，是目前世界上最大、最全面的免费开放的中国传统医学分子数据库，可从
http://tcm.cmu.edu.tw/ 下载[31]。选择PDB ID为
4TPK 的人类BChE的X射线晶体结构进行后续分析，其分辨率为2.70 ?。
分子对接 为了实现可靠的先导化合物识别，本研究采用了当前领域公认的方法[32]、[33]、[34]
虚拟筛选 目标蛋白BChE因其水平升高和在AD晚期的活性增强而被视为有前景的治疗靶点[37]。其三维晶体结构来自RCSB蛋白质数据库（PDB ID：
4TPK ），该蛋白为二聚体BChE，总结构重量为143.43 kDa。选择了一条含有528个氨基酸的链进行计算分析。共结晶配体3F9与BChE结合在活性腔内
结论 本研究采用计算-实验协同范式，从包含60,580种天然化合物的商业数据库中鉴定出BChE的天然抑制剂。结果发现三种生物碱（hirsutine、picrasidine I和picrasidine T）具有强效的抑制作用（IC50 < 10 μM）。详细的机制研究表明，这些抑制剂通过熵驱动的相互作用，同时作用于BChE的催化位点（Ser198/His438）和外围位点（Trp82），实现可逆的混合型抑制。
CRediT作者贡献声明 刘艳： 撰写初稿、研究设计、数据分析、概念构思。
刘毅： 撰写初稿、方法学设计、研究实施、资金申请。
余德洪： 软件开发、方法学支持。
杨灿： 结果验证。
徐海琦： 方法学设计。
王娜： 数据可视化。
杜佳娜： 数据可视化。
李丽子： 方法学设计。
陈刚： 资源协调。
刘泽荣： 资源支持。
涂艳蓓： 研究指导。
李彦芳： 撰写修订、资源整理。
利益冲突声明 作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢 Schr?dinger软件由西南药学院提供。本研究得到了四川省中枢神经系统药物重点实验室（项目编号：210018-01SZ）的支持。
