为在复杂的生物基质中分离蛋白质而定制的界面调控技术，用于制备高亲和力的印迹聚合物

《Journal of Chromatography A》：Tailored interfacial modulation for constructing high-affinity imprinted polymers for protein isolation in complex biological matrices

　　徐新雅|葛艳辉|王璐|王川|谢云东|杨璐萍|史永恒|刘继平 陕西中医药大学药学院，西安，712046，中国 **摘要** 从复杂的生物基质中精确识别高价值蛋白质仍然是分离科学中的一个关键挑战。在这项工作中，我们开发了一种定制的界面调控策略来构建高性能的溶菌酶印迹聚合物。通过界面微环境的调节和双单体方法的结合，实现了稳定且特异性的识别位点的形成。所获得的聚合物表现出竞争性的吸附能力（395.13 mg/g）和高的印迹因子（8.78），并在30分钟内达到平衡。它们对溶菌酶具有良好的选择性，并且在重复的吸附-解吸循环中表现出稳定的性能。通过从真实的生物基质中一步分离出溶菌酶进一步证实了其实际应用性。总体而言，这项工作提供了一种逐步调节界面微环境以高效分离蛋白质的策略。 **引言** 溶菌酶（Lyz，EC 3.2.1.17）是一种广泛使用的抗菌酶，在食品工业（作为天然防腐剂）、制药行业（具有抗炎和抗生素功能）和临床诊断（作为疾病生物标志物）中都有应用[1,2]。随着这些领域需求的增加，高纯度溶菌酶的市场持续扩大，预计在未来几年将达到数十亿美元规模[3,4]。这种增长凸显了开发高效提取技术的经济重要性。鸡蛋白是溶菌酶的主要商业来源；然而，溶菌酶仅占鸡蛋白总蛋白的约3.5%，同时存在大量的杂质，如卵白蛋白（约54%）和卵转铁蛋白（约12%）[5,6]。传统的纯化方法，包括离子交换色谱和盐沉淀，在处理这种复杂的蛋白质基质时，在选择性、操作成本和可扩展性方面存在局限性[2,[7], [8], [9], [10]]。值得注意的是，溶菌酶具有较高的等电点（pI≈10.7），这导致在中性到微碱性pH下具有独特的界面相互作用行为[11]。尽管这一特性为基于相互作用的富集提供了合理的依据，但仅依靠传统离子交换树脂中的简单表面相互作用不足以从复杂的生物基质中特异性地分离溶菌酶[4]。因此，开发一种能够同时进行界面预富集和精确分离的稳定吸附剂对于实际应用非常重要。这种策略对于其他功能性生物大分子的识别也具有更广泛的价值。 分子印迹聚合物（MIPs）是通过在模板周围聚合功能单体形成的合成受体，生成在大小、形状和化学功能上与模板互补的三维空腔[12,13]。与生物抗体相比，MIPs具有热稳定性、化学稳定性和成本效益高的制备优势[[14], [15], [16]]。虽然MIP技术已经成熟，可用于小分子靶标，并在传感和分离领域得到广泛应用，但将其扩展到蛋白质印迹面临重大的技术障碍[17,18]。蛋白质具有较大的流体动力学半径和构象灵活性，并且对涉及有机溶剂、高温或自由基引发剂的传统聚合条件敏感[19]。这些特性可能导致模板深度埋藏、扩散动力学缓慢以及在传统块状聚合物基质中的结合亲和力降低[20]。表面印迹技术通过在外部支撑基底上构建识别位点来解决这些问题，从而提高位点的可访问性和模板的扩散[21,22]。然而，传统的表面印迹协议通常使用形成相对灵活聚合物网络的功能单体。这样的网络在模板去除或再生过程中容易发生空腔变形。对于像溶菌酶这样的紧凑型酶来说，构建一个能够同时结合定制的离子微环境和结构稳定性的表面印迹界面仍然是一个未解决的挑战。 为了克服这些限制，本研究提出了一种综合的界面工程策略来制备高亲和力的溶菌酶印迹聚合物（HL-MIPs）。使用从柑橘网纹柚（Citrus reticulata）皮中提取的磁性生物炭（CPS）作为坚固的平台，通过磁分离提供了有利的化学稳定性和操作便利性[[23], [24], [25]]。为了优化界面微环境，用天冬氨酸对CPS表面进行了功能化，创建了一个有利于溶菌酶初始吸附的离子界面。随后，通过左旋多巴（LD）和咖啡酸（CA）的水相自聚合作用构建了一个生物相容性的识别层。加入咖啡酸的目的是增强聚合物网络的结构完整性，从而可能在模板去除和再生过程中减少空腔变形。所得的HL-MIPs在多次吸附-解吸循环中表现出竞争性的结合能力和出色的重复使用性。这项工作不仅实现了从鸡蛋白中特异性地分离溶菌酶，还为设计用于复杂基质中生物大分子分离的高效识别界面提供了一种多功能方法。 以下试剂均从Titan Scientific Co., Ltd.（中国）购买：左旋多巴（LD）、天冬氨酸（Asp）、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、咖啡酸（CA）、壳聚糖（CS）、草酸铁铵、戊二醛和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。其他所有化学品均为分析级，由中国Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.提供。柑橘网纹柚的皮从陈峪草药市场采购，粉碎成细粉并过60目筛后使用。人血清白蛋白（HSA）、木瓜蛋白酶、溶菌酶（Lyz）、牛血清白蛋白（BSA）、胃蛋白酶和菠萝蛋白酶（BR）均从J&K Scientific Co., Ltd.（中国）购买。 将25克柑橘网纹柚皮粉末与75毫升0.4 M的草酸铁铵水溶液混合，在70°C下进行热浸渍1天。烘干后，在N2气流下于650°C的管式炉中煅烧2小时。用无水乙醇和蒸馏水依次洗涤后，得到最终的柑橘网纹柚皮支撑材料（CPS）。 将350毫克的CPS悬浮在87毫升0.1% v/v醋酸中的2毫克/毫升壳聚糖溶液中，并搅拌1小时。通过稀氨水将pH调整至8.0后，加入50 wt%的戊二醛（9微升）。搅拌3小时后，用水洗涤并在60°C下干燥，得到壳聚糖接枝的CPS（CPS/CS）。将300毫克的CPS/CS浸入25毫升pH 7.0的PBS中。加入239.6毫克的EDC·HCl和143.8毫克的NHS，并搅拌2小时。随后滴加25毫升12毫克/毫升的天冬氨酸溶液，搅拌6小时后，将所得固体干燥，得到天冬氨酸功能化的CPS（CPS/CS/Asp）。将100毫克的CPS/CS/Asp分散在35毫升Tris缓冲液中。