《Journal of Chromatography A》：Chromatographic Resolution and Reliable Quantification of Eleven Endogenous and Microbiota-Derived Tryptophan Metabolites in Human Plasma by HPLC–MS/MS
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Kateryna Tkachenko|Alice Laroni|Marco Ponassi|Davide Maioli|Camillo Rosano|Aldo ProfumoIRCCS Azienda Ospedaliera Metropolitana, Largo Rosann
Kateryna Tkachenko|Alice Laroni|Marco Ponassi|Davide Maioli|Camillo Rosano|Aldo Profumo
IRCCS Azienda Ospedaliera Metropolitana, Largo Rosanna Benzi 10, Genova 16132, 意大利
摘要
色氨酸代谢在宿主-微生物群相互作用和免疫调节中起着核心作用，但由于其多样的理化性质和广泛的动态浓度范围，同时量化犬尿氨酸、血清素和吲哚途径的代谢物在分析上仍然具有挑战性。在这里，我们报道了一种高效的无衍生化HPLC–MS/MS工作流程，用于人体血浆中十一种关键色氨酸衍生物的靶向定量。该方法采用联苯固定相，以实现结构相似分析物的稳健色谱分离，包括那些在C18固定相中共同洗脱的化合物，从而提高色谱选择性并最小化结构相关分析物的共洗脱。样品制备仅需要50 μL的血浆，并依赖于简单的蛋白质沉淀步骤，允许高通量处理。该方法在灵敏度、准确性和重复性方面表现出色，并得到了广泛的内部标准化支持。多途径覆盖、分析周期的结合以及适用于人体血浆的特点，使该工作流程成为监测研究与潜在临床应用中肠道相关代谢特征的宝贵工具。
引言
色氨酸（TRP）代谢在微生物群-宿主通信、免疫调节和神经免疫信号传导中起着核心作用[1,2]。微生物和宿主来源的TRP代谢物影响肠道屏障完整性、免疫细胞激活、氧化平衡和神经传递，这使得这些途径与慢性炎症、代谢和神经系统疾病高度相关[[3], [4], [5]]。超过90%的膳食TRP通过犬尿氨酸（KYN）途径代谢为犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸（3-HK）和犬尿酸（KYNA）等代谢物[6]。这些化合物具有神经保护或神经毒性作用，以及通过芳香烃受体和孕烷X受体等受体介导的强效免疫调节作用[[7], [8], [9]]。剩余的TRP部分转化为血清素（SER）或被肠道微生物群转化为吲哚衍生物，如吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-乳酸（ILA）、吲哚-3-羧醛（I3C）和吲哚酚硫酸盐（INS），这些化合物共同促进肠道-大脑通信和黏膜免疫稳态[10,11]。
由于这些代谢物涉及三个相互连接的生化途径（犬尿氨酸、血清素和吲哚途径），它们为宿主-微生物群相互作用和疾病发病机制提供了宝贵的见解[12,13]。然而，在生物基质中同时量化这些代谢物在分析上仍然具有挑战性。TRP衍生物在极性、芳香性、电离效率和生理丰度方面存在显著差异，这使得它们的提取、色谱保留和峰分离在单一方法中变得复杂。几种HPLC–MS/MS方案尝试了广泛的TRP途径覆盖，但仍存在重要限制。Eggersten等人[14]展示了选定犬尿氨酸和血清素途径代谢物的量化；然而，该方法仅限于有限的代谢物组，并未包括微生物群来源的吲哚代谢物，从而限制了途径的全面性。类似地，T?m?si等人[15]报告的靶向LC–MS/MS方法也仅关注了一小部分关键代谢物（例如TRP、KYN、KYNA），缺乏更广泛的途径整合。更全面的方法虽然实现了更广泛的代谢物覆盖，但依赖于复杂的色谱条件，如离子配对，并且仍然面临与基质效应和信号变异相关的挑战[16]。其他优先考虑短分析时间的方法虽然实现了高通量，但通常会降低色谱分辨率，增加了对MS选择性的依赖[17]。总体而言，先前报道的方法要么仅针对有限的代谢物子集，要么需要复杂的色谱策略并依赖衍生化策略来提高极性TRP代谢物的检测能力和保留[18]，要么严重依赖基于MS的区分能力，这突显了需要结合广泛覆盖和有效色谱分离的稳健方法。
为了设计一种适用于常规和高通量应用的方法，选择合适的生物基质也非常关键。血浆和血清是最常见的临床靶向代谢组学基质；然而，对于某些TRP代谢物来说，它们的生化行为存在显著差异。
在这种背景下，我们开发了一种无衍生化的HPLC–MS/MS工作流程，用于同时量化犬尿氨酸、血清素和吲哚途径中的十一种TRP代谢物（图1）。该方法将色谱性能作为核心设计原则，采用联苯固定相，与C18柱相比，对结构相似的芳香族和极性化合物提供了更好的选择性。这一策略使得难以分离的分析物对能够实现基线分离，并最小化了仅依赖MS区分的需求。优化的简单蛋白质沉淀协议仅需50 μL的血浆，确保了高样品通量和与转化研究的兼容性。通过结合高色谱选择性、简化的样品制备和生物学上合理的基质选择，该方法提升了当前的分析能力，并支持对肠道健康、免疫激活和微生物群-宿主代谢相互作用的临床和转化研究。
部分摘录
化学品和试剂
所有溶剂均为LC–MS等级。甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、二甲基亚砜（DMSO）、丙酮和甲酸（FA）均从Fisher Scientific（Segrate, MI, 意大利）购买。超纯水使用Milli-Q纯化系统（Merck Millipore, Darmstadt, 德国）生成，并用于所有流动相。3-HK、SER、KYN、KYNA、TRP、INS、TRPA、IAM、IAA、I3C和ILA的未标记分析标准品来自Merck。稳定同位素标记的内部标准品（ISs）
结果与讨论
尽管人们对色氨酸代谢及其在微生物群-宿主相互作用中的参与越来越感兴趣，但大多数分析方法仅关注单一代谢途径，并且通常包括衍生化或劳动密集型的预处理[17,18]。在这种背景下，我们开发了一种无衍生化的HPLC–MS/MS工作流程，能够同时量化色氨酸和与肠道和免疫健康相关的十一种下游代谢物。该方法强调色谱选择性作为核心
结论
我们开发了一种简单、选择性高且可重复的LC–MS/MS方法，用于人体血浆中十一种色氨酸相关代谢物的同时量化。全面的验证包括对基质效应、提取回收率、定量限和内源性化合物固有的分析挑战的系统性评估。影响稳健性的关键因素——例如色胺的保留时间变化、血浆蛋白结合和血清素浓度的升高
缩写
3-HK，3-羟基犬尿氨酸；ACN，乙腈；AGC，自动增益控制；DMSO，二甲基亚砜；EIC，提取离子电流；FA，甲酸；HQC，高质量控制；HR，高分辨率；I3C，吲哚-3-羧醛；IAA，吲哚-3-乙酸；IAA-d4，吲哚-3-乙酸-d4；IAM，吲哚-3-乙酰胺；ILA，吲哚-3-乳酸；INS，吲哚酚硫酸盐；IS，内部标准；ISs，内部标准品；KYN，L-犬尿氨酸；KYN-d4，L-犬尿氨酸-d4；KYNA，犬尿酸；KYNA-d5，犬尿酸-d5；
Sample CRediT作者声明
Kateryna Tkachenko：研究、数据管理、初稿撰写。Alice Laroni：资金获取、资源协调、样品获取、审稿和编辑。Marco Ponassi：验证。Davide Maioli：样品获取、审稿和编辑。Camillo Rosano：监督。Aldo Profumo：概念构思、方法论、审稿和编辑。
CRediT作者贡献声明
Kateryna Tkachenko：撰写——初稿、研究、数据管理。Alice Laroni：撰写——审稿与编辑、资源协调、资金获取。Marco Ponassi：验证。Davide Maioli：撰写——审稿与编辑。Camillo Rosano：监督。Aldo Profumo：撰写——审稿与编辑、方法论。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了意大利卫生部的IRCCS AOM项目5×1000的支持。代码5M-2020-23682093。AL的研究由意大利卫生部（Ricerca Corrente）资助，并得到了#NEXTGENERATIONEU（NGEU）和大学与研究部（MUR）的支持，以及国家恢复与韧性计划（NRRP）项目MNESYS（PE0000006）——（DN. 1553 11.10.2022）的资助。
