《Advanced Science》：Unraveling the Molecular Mechanisms Underlying Spontaneous Multipolar Mitosis Through CIN-seq
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为解决染色体不稳定性（CIN）中罕见且动态的多极分裂现象研究难题，研究人员开发了CIN-seq技术，实现了对活细胞中自发多极分裂的大规模单细胞多组学分析。研究发现，16号染色体非整倍性与三极分裂增加相关，Rho GTPase周期激活驱动胞质分裂失败，而PTEN信号减弱通过BCL2L1促进了细胞存活，揭示了癌细胞适应染色体不稳定的新机制，为靶向CIN的癌症治疗提供了新思路。
在癌症的复杂世界中，细胞分裂出错是推动肿瘤进化和产生治疗抵抗的常见驱动力。其中，多极分裂（multipolar mitosis）是染色体不稳定性（Chromosomal Instability, CIN）的一个典型标志。与正常细胞将遗传物质精确分配到两个子细胞不同，发生多极分裂的癌细胞会错误地将染色体分离到三个或更多“极”，产生具有混乱染色体组成的后代。这种现象在肿瘤中自发发生，虽然罕见，却能产生具有高异质性和生存能力的癌细胞克隆，从而加速肿瘤恶化。然而，由于这些事件稀有、动态且难以在活细胞中捕获，其背后的根本分子机制一直如迷雾般难以拨开。传统的遗传扰动或药物诱导方法，虽然能人为扩大异常分裂的细胞群体以便于研究，却可能掩盖了“自发”发生的自然过程。此外，现有的单细胞测序技术虽然能分析细胞群体的异质性，却无法将特定的异常分裂“表型”与测得的基因“型”直接关联，也无法捕获与CIN相关的时间性基因表达变化。这些技术瓶颈严重限制了我们理解癌症如何利用染色体不稳定来自我强化，也阻碍了针对CIN开发有效疗法。为了照亮这个“盲区”，一项发表在《Advanced Science》上的研究带来了突破性工具——CIN-seq（Chromosome Instability Sequencing，染色体不稳定性测序），并以乳腺上皮细胞MCF10A为模型，首次对活细胞中自发发生的多极分裂进行了大规模、单细胞精度的分子解码，揭示了一系列前所未见的调控机制。
研究人员开展这项研究主要运用了几个关键技术方法。首先是自主开发的CIN-seq技术平台，其核心包括：1) 使用超大视野光学（UFO）显微镜对约105-6个活细胞进行高速成像筛查；2) 基于真实标注辅助的可训练Weka分割（GTWeka）算法进行实时细胞分割；3) 利用固定半径近邻搜索法，快速、自动地识别并记录正在进行多极分裂等CIN表型的单细胞；4) 通过光激活染料对目标细胞进行自动“光标记”，随后利用流式细胞分选（FACS）将其分选出来。基于此平台，研究人员对分选出的细胞进行了：5) 基于384孔板的单细胞DNA测序（scDNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq），以分析其基因组拷贝数变异（CNV）和转录组特征。此外，研究还运用了CRISPR成像技术对特定染色体进行活细胞可视化，并通过荧光原位杂交（FISH）和一系列小分子化合物（如Rho GTPase激活剂、PTEN抑制剂、BCL2L1抑制剂等）处理实验，对组学发现的关键通路和基因进行了功能验证。
2.1 用于筛查、检测和单细胞多组学分析发生活体、自发多极分裂的细胞亚群的CIN-seq的开发
研究人员开发了CIN-seq这一整合成像与测序的平台，实现了对海量活细胞中罕见CIN事件的高通量筛查、实时检测、自动标记和单细胞分选，为后续的分子机制研究奠定了基础。
2.2 三极分裂产生的子代细胞表现出多倍体或高染色体变异性
通过CIN-seq介导的单细胞基因组学分析发现，经历三极分裂的细胞具有极高的存活率，其子代细胞表现出两种截然不同的命运：约一半细胞具有混乱的拷贝数变异（CNV）谱，染色体组成高度异质；另一半细胞则具有看似正常的CNV谱，但其中约75%实际上是多倍体（从三倍体到八倍体），这提示胞质分裂失败的发生。
2.3 16号染色体的非整倍性与较高的三极分裂率相关
对三极分裂细胞进行克隆扩增和批量DNA测序发现，携带16号染色体额外拷贝的克隆其三极分裂率显著升高。利用CRISPR成像技术对活细胞中16号染色体进行计数，直接证实了三极分裂的母细胞中16号染色体的拷贝数（尤其是不均等的奇数拷贝）显著高于双极分裂的细胞，验证了16号染色体非整倍性与多极分裂的相关性。
2.4 RhoGTPase循环信号通路驱动胞质分裂失败，导致多倍体细胞形成
单细胞转录组分析将细胞分为三个Seurat簇，其中S1簇包含多倍体的双极和三极分裂细胞。通路分析显示，这些多倍体细胞中RhoGTPase循环信号通路显著上调。功能实验证实，激活Rho GTP信号会增加胞质分裂失败率，但单独激活该通路并不足以诱发三极分裂，表明RhoGTPase通路主要驱动了多倍体的形成，而非多极分裂本身。
2.5 去颗粒化样信号在TP细胞中被激活并与应激反应性溶酶体程序相关
转录组分析发现，三极分裂细胞，特别是具有混乱CNV谱的TP-S2亚型，显著激活了中性粒细胞去颗粒化样信号通路。一系列与颗粒或溶酶体区室相关的酶（如CTSD、CSTB等）表达上调，表明细胞激活了一个应激诱导的溶酶体蛋白水解网络来应对多极分裂后的蛋白毒性应激。出乎意料的是，抑制关键酶CTSD反而提高了三极分裂子代细胞的存活率，表明该通路可能扮演了一个清除严重损伤细胞的“质检”关卡角色。
2.6 PTEN信号减弱和BCL2L1上调协同促进TP细胞在溶酶体应激下的存活
整合分析揭示了三极分裂细胞中PTEN依赖的信号网络发生了广泛重塑：PTEN表达下调，其下游的SHC1、GRB2、CCND1和BCL2L1基因上调，而ROCK1和ROCK2基因下调。这导致细胞周期检查点通路被抑制，细胞周期进程蛋白CCND1表达增加，从而使得细胞即使存在基因组异常也能强行完成分裂。同时，抗凋亡蛋白BCL-xL（由BCL2L1编码）的表达上调，对细胞存活至关重要。功能实验证实，抑制PTEN会增加胞质分裂失败和三极分裂的发生率，而抑制BCL2L1则会特异性降低三极分裂细胞的存活率。研究提出了一个统一模型：PTEN信号减弱通过促进细胞周期进程、抑制检查点、上调BCL2L1，共同驱动了可存活且成功的三极分裂。
